布鲁氏菌荧光偏振（FPA）检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及布鲁氏菌荧光偏振(FPA)检测试剂盒。本发明专利技术使用了异硫氰酸荧光素(FITC)标记光滑型布鲁氏菌O链脂多糖小分子片段(OPS)，作为抗原。基于FPA的实验原理，该试剂盒能对多种动物进行布病检测，同时能检测血清中的IgG和IgM类抗体，因此该试剂盒在敏感性方面具有更明显的优势；本发明专利技术通过对主要试剂配方的改进和优化，特别是对阳性血清的效价进行了精确标定，有效提高了试剂盒的敏感性和特异性，敏感性、重复性、保存期、操作方便性等问题，大大缩短了高通量检测所需的时间，本发明专利技术为我国布鲁氏菌病诊断提供了新型高效的检测方法。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种动物布鲁氏菌病的诊断方法——布鲁氏菌荧光偏振(FPA)检测试剂盒，属生物制品检测

技术介绍
布鲁氏菌病(Brucellosis)简称布病，是由布鲁氏菌引起的以感染家畜为主的人畜共患传染病。本病不但对动物的繁殖和生产性能具有严重危害，更重要的是，人感染布鲁氏菌后，往往难以治愈，从而造成严重的公共卫生问题。目前全世界范围内消除该病的主要方法是扑杀与免疫相结合，所以建立快速准确的诊断方法对防治和清除布病非常必要。布鲁氏菌抗体检测常用血清学方法有虎红平板凝集试验(RBT)、试管凝集试验(SAT)、补体结合试验(CFT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和荧光偏振试验(FPA)。其中SAT因特异性不高，通常认为不适合国际贸易检测；RBT、CFT和ELISA为国际贸易指定试验；FPA为国际贸易选择试验。FPA利用生物物理学方法实现了对疾病的快速检测，其基本原理是荧光物质经单一平面的蓝偏振光(485nm)照射后，吸收光能跃入激发态，随后回复至基态，并发出单一平面的偏振荧光(525nm)。偏振荧光的强弱程度与荧光分子的大小呈正相关，与其受激发时转动的速度呈反相关。本专利技术中，我们在布鲁氏菌O链多糖(OPS)上标记荧光素分子(FITC)，当布鲁氏菌特异性抗体与抗原结合形成抗原/抗体复合物后，分子量变大，此时检测到的荧光偏振程度也较高，当检测到的偏振强度值超过cutoff值时，即判为布病阳性，反之为阴性。到时相对于ELISA方法，FPA特具有更高的检测效率，并具有良好的特异性和敏感性；另外，其试验操作也比ELISA简单，特别适合于对大量样品的检测，在布鲁氏菌血清学检测中有特定的优势。本申请人在成功开发了牛布病间接ELISA试剂盒、动物布病竞争ELISA试剂盒和布鲁氏菌抗体检测试纸条的基础上，又开发成功了布鲁氏菌荧光偏振检测试剂盒。
技术实现思路
本专利技术的目的在于建立了一种布鲁氏菌抗体高通量检测技术。其核心是将提纯的光滑型布鲁氏菌O链脂多糖(OPS)标记上异硫氰酸荧光素，经精确定量后用作检测抗原。以人工免疫健康牛制备阳性血清，以健康非免疫牛血清作阴性血清，及25×样品稀释液等组分组装而成，用于检测多种动物血清中的光滑型布鲁氏菌抗体。本专利技术的技术方案1.一种布鲁氏菌荧光偏振检测试剂盒，其特征在于该试剂盒由布鲁氏菌荧光标记抗原OPS、布鲁氏菌阳性对照血清、阴性对照血清和样品稀释液组成。2.如权利要求1所述一种布鲁氏菌荧光偏振检测试剂盒，其特征在于其中的布鲁氏菌荧光标记抗原OPS是检测布鲁氏菌抗体的荧光标记光滑型布鲁氏菌S2株脂多糖的小分子片段，该OPS对常见的布鲁氏菌病原抗体均具有良好的特异性和敏感性。3.权利要求1所述的布鲁氏菌荧光偏振检测试剂盒的应用，该可检测多种动物血清中的布鲁氏菌特异性抗体，即该试剂盒能对猪、牛、羊的布鲁氏菌病进行高通量快速检测。本专利技术具体实施方式布鲁氏菌荧光偏振检测试剂盒。通过对标记抗原、反应条件、结果判断标准等多方面条件的优化，特别是对阳性血清的效价进行了精确标定，比较理想地解决了布鲁氏菌荧光偏振试验诊断方法中特异性、敏感性、重复性、保存期、操作方便性等问题。本专利中使用了异硫氰酸荧光素(FITC)标记光滑型布鲁氏菌O链脂多糖小分子片段(OPS)，作为抗原。基于FPA的实验原理，该试剂盒能对多种动物进行布病检测，同时能检测血清中的IgG和IgM类抗体，因此该试剂盒在敏感性方面具有更明显的优势。在本专利技术实施过程中，为了客观评价试剂盒的特异性和敏感性，将近6年收集的343份田间牛、羊的血清样本，经虎红凝集试验初筛后，再用试管凝集试验和补体结合试验检测，剔除了部分检测结果不一致的样本，共确定了148份布病阳性血清(其中牛血清70份，羊血清78份)，155份布病阴性血清(其中牛血清82份，羊血清73份)。本专利技术开发的试剂盒，与已确认的148份布病阳性血清样本的符合率为98.0％(145/148)，与已确认的155份阴性样本的符合率为98.7％(153/155)，由此确定试剂盒对田间样本的敏感性为98.0％，特异性为98.7％，显示了试剂盒诊断结果的可靠性。本专利技术所述的布鲁氏菌荧光偏振检测试剂盒，选取猪种布鲁氏菌S2株作为OPS提取的生产菌种，在常规提取OPS方法的基础上，增加了蛋白酶K消化和浓缩步骤，提高了OPS浓度和纯度。具体技术方案如下：1.OPS提取(1)将灭活菌悬液以10000g离心20min，收集沉淀。称量并计算菌体湿重，将菌体湿重按1:8(W/V)比例加入2％(V/V)醋酸中，121℃高压灭菌15min。4℃以10000g离心20min去除菌体碎片。(2)在上清液中加入终浓度为5％的三氯乙酸，室温搅拌15min后，4℃10000g离心10min，弃去沉淀。加入一定量的蛋白酶K，使其终浓度达50μg/ml，置56℃水浴消化2小时。(3)上清液置100倍蒸馏水透析过夜，用PEG8000浓缩40倍，再次置于蒸馏水透析过夜，收集透析袋内容物，分装成2ml/瓶冻干保存，此即提纯的OPS。2.建立了FITC-OPS分子标记方法(1)将4mgOPS加入到2ml0.5％(V/V)的三乙胺溶液中，置冰上超声处理15min，超声后加入200μl100mmol/L的EDTA溶液，并用10μl1mol/L的盐酸将溶液pH调为5.0。(2)取20mgFITC(异构体I)溶解于800μl0.25mol/L硼酸溶液(pH10.5)中，然后全部加入到OPS溶液中，继续超声处理1min。加入1ml1.6％脱氧胆酸钠溶液，37℃搅拌孵育18小时。(3)4℃10000g离心30min，将上清液转移到透析袋中用PEG6000浓缩，随后用PBS透析1小时，将透析物用PD-10柱脱盐，收集所有FITC-OPS标记物，合并后用PEG6000再浓缩，最后再用PBS透析1小时，收集透析后产物4℃保存，即为标记抗原原液。3.FPA试剂盒阳性血清的效价标定(1)用布鲁氏菌虎红平板凝集试验、试管凝集试验和补体结合试验对临床表现健康的2岁左右成年牛进行检测，筛选布病抗体阴性牛。(2)将布鲁氏菌参考强毒株M28灭活抗原以5×1010CFU/牛颈部皮下免疫，3个月后双倍剂量加强免疫1次。加强免疫后2周采血。(3)用试管凝集试验测定凝集效价，当效价超过800IU/ml时，静脉放血，分离血清。根据实际测定的效价，用牛布病阴性血清将其效价稀释至320IU/mL，用0.45μm滤器过滤除菌，作为试剂盒中布病阳性血清。4.PFA试剂盒的特异性和敏感性评价(1)将2009～2015年间课题组收集的343份田间牛、羊的血清样本，分别用虎红平板凝集试验和试管凝集试验检测，将两种方法均检测为阳性的血清样本和均检测为阴性的样本再用补体结合试验确认，选择三种方法全为阳性的血清作为阳性参考血清，三种方法全为阴性的血清作为阴性参考血清。(2)用筛选出的148份确定为布病阳性的血清(其中牛血清70份，羊血清78份)和155份布病阴性血清(其中牛血清82份，羊血清73份)作为待检血清，评价试剂盒的敏感性和特异性。附图说明图1猪种布鲁氏菌S2的PCR鉴定鉴定图图中1:DNAMarker；2:大肠杆菌阴性对照；3:S2菌株的PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种布鲁氏菌荧光偏振检测试剂盒，其特征在于该试剂盒由布鲁氏菌荧光标记抗原OPS、布鲁氏菌阳性对照血清、阴性对照血清和样品稀释液组成。

【技术特征摘要】
1.一种布鲁氏菌荧光偏振检测试剂盒，其特征在于该试剂盒由布鲁氏菌荧光标记抗原OPS、布鲁氏菌阳性对照血清、阴性对照血清和样品稀释液组成。2.如权利要求1所述一种布鲁氏菌荧光偏振检测试剂盒，其特征在于其中的布鲁氏菌荧光标记抗原OPS是检测布鲁氏菌抗体的荧光标...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋卉，丁家波，孙翠丽，冯宇，程君生，朱良全，彭小薇，张磊，
申请(专利权)人：中国兽医药品监察所，
类型：发明
国别省市：北京;11