联产异戊二烯和1,3-丙二醇的基因工程菌及构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种联产异戊二烯和1,3‑丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程技术领域。本发明专利技术在基因工程菌株中整合了甘油脱水酶基因、甘油脱水酶再激活酶基因、敲除了甘油激酶基因，并过表达了HMG‑CoA还原酶、HMG‑CoA合成酶、甲羟戊酸激酶、磷酸甲羟戊酸激酶、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶、IPP异构酶、异戊二烯合成酶、醛还原酶和转氢酶。本发明专利技术利用基因工程手段在大肠杆菌体内成功构建了联产异戊二烯和1,3‑丙二醇的代谢途径，利用该方法使基因工程菌株细胞内的氧化还原辅因子代谢平衡，并提高了利用葡萄糖和甘油发酵联产异戊二烯和1,3‑丙二醇的产率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种联产异戊二烯和1,3-丙二醇的基因工程菌及其构建方法和应用，属于基因工程
技术背景异戊二烯(2-甲基-1,3-丁二烯)是目前公认的极具商业应用价值的重要化工平台化合物。异戊二烯是合成橡胶的主要单体，其用量占异戊二烯总产量的95％。此外，异戊二烯还广泛应用于医药或化工中间体、食品、粘合剂及航空燃料等领域。目前，异戊二烯的制备方法主要有石油基原料异戊烷、异戊烯脱氢法、化学合成法(包括丙烯二聚法、乙炔-丙酮法、异丁烯-甲醛法)和裂解C5馏分萃取蒸馏法等。然而，随着化石资源的日益枯竭和价额的不断攀升，原料供给问题必然成为制约异戊二烯生产的重要瓶颈。另外，化学法制备异戊二烯的过程中普遍存在能耗高、工艺复杂、对设备要求高、环境污染严重和产物收率低等问题，制约着异戊二烯工业化生产的发展。因此，寻找可持续的异戊二烯生产方式是今后异戊二烯工业生产的重要发展趋势。与传统化学法相比，以生物转化和生物催化为核心的微生物发酵法具有环境友好、利用廉价的可再生原料、可持续发展等优势。因此，微生物合成成为异戊二烯制备领域的重要研究方向。利用天然微生物合成异戊二烯的主要问题是产量低，无法满足工业生产的要求。因此，利用代谢工程构建基因工程菌成为提高异戊二烯产量的重要手段[1]。然而，代谢工程改造常常不能得到预期的效果，这与人们对细胞内的代谢过程和调控过程还不够了解有着很大的关系。异戊二烯生物合成中均需要辅酶的参与，辅酶代谢与物质代谢一样，在发酵过程中占有重要地位。从葡萄糖合成异戊二烯的化学反应方程式：1.5C6H12O6+2NADPH+6NAD+→C5H8+4CO2+6NADH+2NADP++H2O+4[H+]从方程式来看，1.5分子葡萄糖合成1分子异戊二烯的过程中消耗2分子NADPH，并生成6分子NADH，整个反应中的氧化还原型辅酶的代谢是不平衡。为了满足生物合成中对还原力NADPH的需求，杰能科公司过表达磷酸葡萄糖酸内酯酶(PGL)提高磷酸戊糖途径(PPP)的效率，促进NADPH的生成，从而提高了异戊二烯的产率[2]。然而，PPP途径代谢流增加会催化产生CO2，造成碳源的浪费，降低转化率。此外，Stephanie等人在含有MVA途径的重组大肠杆菌中过表达转氢酶PntAB，异戊二烯产量提高3-4倍[3]。这种方法中PntAB的作用是将细胞内高浓度的NADH转化为NADPH：NADH+NADP+→NADPH+NAD+因此，1.5分子葡萄糖合成1分子异戊二烯的过程中产生的6分子NADH在PntAB作用下转化为6分子NADPH，可以满足异戊二烯合成中对NADPH的需求，不需要额外消耗碳源产还原力，从而提高了异戊二烯产量。从理论上来看，该方法中6分子NADPH中2分子NADPH用于异戊二烯合成外还剩余4分子NADPH，这部分过剩的还原力除了供细胞内其他物质合成外将会从呼吸链损失掉，对于生物合成来说是一种能量的浪费。主要参考文献：[1]VickersCE,SabriS.Isoprene.AdvBiochemEngBiotechnol.2015,148:289–317.[2]BeckZQ,CervinMA,NielsenAT,etal.CompositionsandmethodsofPGLfortheincreasedproductionofisoprene:US,8455236B2.2013-06-04.[3]DoneskeS,CampbellP.Microorganismandprocessforisopreneproduction:WO2013119340A1.2013-08-15.
技术实现思路
针对上述情况，本专利技术提供了一种新的方法来平衡异戊二烯生物合成反应中氧化还原型辅酶的代谢。该方法将异戊二烯和另一种重要的化工产品1,3-丙二醇进行了联产。1,3-丙二醇作为一种重要的化工产品，其最主要的用途是作为单体合成新型聚对苯二甲酸丙二酯(PTT)，在合成纤维材料、聚酯膜、工程塑料和纺织服装材料领域的应用前景非常广泛。本专利技术在大肠杆菌中构建了异戊二烯和1,3-丙二醇联产途径，使基因工程菌在甘油和葡萄糖混合碳源发酵中利用葡萄糖合成异戊二烯，利用甘油合成1,3-丙二醇。其中，1,3-丙二醇的合成途径中醛还原酶yqhD基因的催化活性需要以NADPH作为辅酶，其代谢反应方程式如下：C3H8O3+NADPH+H+→C3H8O2+NADP++H2O在1,3-丙二醇单产途径中，对还原力NADPH的需求将使菌株消耗更多的碳源。构建异戊二烯和1,3-丙二醇联产途径，并过表达转氢酶pntAB基因，使用基因工程手段使联产菌株利用葡萄糖合成异戊二烯，利用甘油合成1,3-丙二醇。从而，基因工程菌株在葡萄糖和甘油混合碳源发酵中可以将异戊二烯合成途径中过剩的4分子NADPH用来满足1,3-丙二醇生物合成对还原力的需求，联产反应方程式为：1.5C6H12O6+4C3H8O3→C5H8+4C3H8O2+4CO2+5H2O异戊二烯和1,3-丙二醇的理论质量产率分别为25％和82.6％，该方法一方面可以实现基因工程菌细胞内氧化还原型辅因子的代谢平衡，优化微生物功能；另一方面为目标产物的合成提供了还原力，从而使生物转化效率得到提高，达到提高产物产率的目的。本专利技术提供的异戊二烯和1,3-丙二醇的联产工程菌，是在宿主菌基因组上整合甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活酶基因、敲除了甘油激酶基因，并过表达了乙酰辅酶A酰基转移酶/HMG-CoA还原酶基因、HMG-CoA合成酶基因、甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因、异戊二烯合成酶基因、醛还原酶基因和转氢酶基因而得，重组后的基因工程菌株可以利用葡萄糖和甘油混合碳源联产异戊二烯和1,3-丙二醇。所述宿主菌为大肠杆菌。所述甘油脱水酶基因(dhaB123)来源于肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae(dhaB1GenbankID：7947197；dhaB2GenbankID：7947198；dhaB3GenbankID：7947200)和甘油脱水酶再激活酶基因(gdrAB)来源于肺炎克雷伯菌Klebsiellapneumoniae(gdrAGenbankID：6936977；gdrBGenbankID：6938011)；乙酰辅酶A酰基转移酶/HMG-CoA还原酶基因(mvaE)来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，GenBankNo：AAG02438；HMG-CoA合成酶基因(mvaS)来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)，GenBankNo：AAG02439；甲羟戊酸激酶基因ERG12(GenbankID：855248)、磷酸甲羟戊酸激酶基因ERG8(GenbankID：855260)、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因ERG19(GenbankID：100195467)、异戊烯焦磷酸异构酶基因IDI1(GenbankID：855986)均来源于酿酒酵母Saccharomycescerevisiae；异戊二烯合成酶基因(ispS4)来源于银白杨Populusalba，GenbankNo：AB198180；转氢酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种联产异戊二烯和1,3‑丙二醇的基因工程菌，其特征在于：其基因组在宿主菌基因组上整合甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活酶基因、敲除了甘油激酶基因，并过表达了乙酰辅酶A酰基转移酶/HMG‑CoA还原酶基因、HMG‑CoA合成酶基因、甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因、异戊二烯合成酶基因、醛还原酶基因和转氢酶基因。

【技术特征摘要】
1.一种联产异戊二烯和1,3-丙二醇的基因工程菌，其特征在于：其基因组在宿主菌基因组上整合甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活酶基因、敲除了甘油激酶基因，并过表达了乙酰辅酶A酰基转移酶/HMG-CoA还原酶基因、HMG-CoA合成酶基因、甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因、异戊二烯合成酶基因、醛还原酶基因和转氢酶基因。2.根据权利要求1所述基因工程菌，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌。3.一种权利要求1或2所述基因工程菌的构建方法，其特征在于：在宿主菌基因组上整合甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活酶基因、敲除甘油激酶基因，得到重组宿主大肠杆菌；再过表达乙酰辅酶A酰基转移酶/HMG-CoA还原酶基因、HMG-CoA合成酶基因、甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因、异戊二烯合成酶基因、醛还原酶基因和转氢酶基因。4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：步骤如下：1)宿主菌基因的整合：将甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活酶基因整合到宿主菌基因组上，获得基因整合宿主菌；2)宿主菌的基因敲除：将步骤1)所得的基因整合宿主菌的甘油激酶基因敲除，获得重组宿主菌；3)重组质粒的构建：将乙酰辅酶A酰基转移酶基因/HMG-CoA还原酶基因、HMG-CoA合成酶基因以及异戊二烯合成酶基因、醛还原酶基因和转氢酶基因克隆到pACYCDuet-1质粒载体上，得到重组质粒1；将甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因克隆到pTrcHis2B得到重组质粒2；4)基因工程菌的构建：将步骤3)所得的两个重组质粒1和重组质粒2转化步骤2)所得的重组宿主菌中，获得基因工程菌。5.根据权利要求3或4所述的构建方法，其特征在于：所述宿主菌为大肠杆菌；所述甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活酶基因来源于肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae)；所述乙酰辅酶A酰基转移酶基因/HMG-CoA还原酶基因和HMG-CoA合成酶基因来源于粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)；异戊二烯合成酶基因来源于银白杨(Populusalba)；甘油激酶基因、转氢酶基因、醛还原酶基因来源于大肠杆菌(Escherichiacoli)；甲羟戊酸激酶基因、磷酸甲羟戊酸激酶基因、焦磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因、异戊烯焦磷酸异构酶基因优选来源于酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。6.一种利用权利要求1或2所述的基因工程菌联产异戊二烯和1,3-丙二醇的方法，步骤包括：1)宿主菌基因的整合：将甘油脱水酶基因和甘油脱水酶再激活酶基...

【专利技术属性】
技术研发人员：咸漠，刘会洲，郭静，曹玉锦，
申请(专利权)人：中国科学院青岛生物能源与过程研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37