人骨髓、脐带血、外周血干细胞分离试剂盒及其分离方法技术

本发明专利技术提供了一种人骨髓、脐带血、外周血干细胞分离试剂盒及其分离方法，所述分离试剂盒中包括以下三种试剂：试剂A为氯化钠溶液，试剂B为含羟乙基淀粉、混合抗体的氯化钠溶液；试剂C为碘克沙醇工作液或淋巴细胞分离液。试剂B中，所述羟乙基淀粉的质量浓度为5‑10％，所述混合抗体的浓度为4‑12微克/毫升。本发明专利技术的分离方法应用负选收集法，选择性地出去红细胞，血小板，全部血浆物质，成熟的血细胞及淋巴细胞；能够收集所有的lin阴性的干/祖细胞；不需要采用动员剂，无血浆残留；可以分离大容量骨髓、脐带血和外周血，细胞回收率达到了85％。尤其合适于脐带血库和临床抽取的骨髓、脐带血和外周血样品处理。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种人骨髓、脐带血和外周血干细胞分离试剂盒及其分离方法，具体涉及到运用负选法原理制成的快速分离大容量人骨髓，脐带血，外周血干细胞的试剂盒，由稀释液，分离液和洗涤液组成，以适应临床干细胞治疗所需。
技术介绍
2007年步入岁末，生命科学界再次涌起波涛。日本和美国两个课题组相继运用转基因技术，在普通人的成纤维细胞导入Oct4，nanog，sox2等基因，发现成纤维细胞重新编程具备了人类胚胎干细胞的特性。这一研究成果引起了全世界震动。美国政府再接再厉，投入30亿美元资金，继续深入该课题的研究。干细胞研究的这一成果，大大缩短了将人类胚胎干细胞运用于临床的距离。总所周知，干细胞是一类具有自我更新能力，能够分化为其他种类细胞，本身处于未分化状态的细胞。干细胞目前按照其分化能力可以分为全能，多能和定向干细胞三种。根据其来源，则可分为胚胎干细胞和成体干细胞。我们人类就是通过受精卵这个全能干细胞不断分化而来的。1998年，美国威斯康辛麦迪逊大学的汤姆逊教授领导的课题组成功地建立了人类胚胎干细胞系，这一成果被誉为胚胎干细胞研究的里程碑，此后，干细胞领域的研究一直成为生命科学研究的前沿和热点。仁济医学院消化所经过多年的努力，于2006年成功建立了三株人类胚胎干细胞系，同时开始了将成体干细胞运用于肝脏疾病治疗的探索。干细胞的研究，正在成为人类疾病治疗的新曙光。(一)人类胚胎干细胞研究和临床疾病的治疗胚胎肝细胞，是具有多能性的细胞，在体外合适的诱导条件下，可以成功的诱导出各种细胞。美国UW的张素春博士，在运动神经元细胞的诱导中取得突破性进展。而威斯康辛灵长类研究所的科学家，则将猴子胚胎干细胞诱导所得的神经细胞移植到帕金森氏病候模型上，整个实验历时十年，最终获得成功，移植细胞完全治愈了病患猴子。而明尼苏达大学的丹·考夫曼博士克服了技术上的障碍，在诱导胚胎肝细胞获得能够杀伤肿瘤的免疫细胞上取得突破。仁济医院消化所干细胞实验室的蒯小铃博士运用胚胎肝细胞诱导肝脏细胞，取得了成功。在血液细胞的诱导方面，美国，英国，加拿大各国顶尖实验室，都投入大量人力，物力，全力以赴地希望获得可供移植的造血细胞。美国UW的麦克西姆博士运用一种名叫OP9的小鼠支持细胞，共培养人类胚胎干细胞，获得大量的造血干细胞。米克巴迪亚教授领导的加拿大McMaster大学肿瘤和干细胞研究所成功运动人类胚胎干细胞，建立了稳定的体外培养和诱导体系，成功地从胚胎干细胞中获得具有进一步分化潜力的造血干细胞。仁济医学院的科学家在综合上述两大顶尖实验室的基础上，建立了可从人类胚胎干细胞大规模获得可供移植的造血干细胞的体外诱导体系(见图1)。胚胎干细胞要正真运用到临床，还有遥远的道路，其中，最主要的难点有两点，其一：如何解决免疫排斥的问题。对于这个问题，有着不同的思路，有人提出，可运用核移植的方法，将病人的体细胞去核，移植到去核的卵细胞中，然后再将杂合细胞推动到胚胎的囊胚阶段，从中分离胚胎干细胞。近期克隆猴的成功为这一思路的实现带来了希望。另有学者提出利用孤雌生殖的方式获得人类的胚胎。这方面的成果尚需进一步探讨。而上述的从皮肤细胞获得人类胚胎干细胞，是一个崭新的思路，但获得细胞的过程中导入基因的手段涉及到病毒，对于该细胞未来是否可以真正运用于临床治疗病人，还有待后续实验的进一步深入。胚胎肝细胞运用于临床疾病治疗的另一忧人之处是干细胞本身形成畸胎瘤的特性。虽然分化所得的细胞在移植中尚未发现成肿瘤的现象，但对于胚胎干细胞在体外扩增中是否存在着类似肿瘤的表观遗传的改变，是一个值得重视的命题。(二)成体干细胞研究和临床疾病治疗成体干细胞运用于临床疾病的治疗，如骨髓干细胞，脐血或外周血干细胞移植治疗血液病，已经报道很多。单用骨髓干细胞治疗非造血系统疾病，近年来则越来越受到重视。随着临床研究的迅速发展及安全性提高，这一技术的运用已经扩展至其他各个领域，包括治疗帕金森氏症，老年性痴呆症，骨折，股骨头坏死，骨质疏松症，心血管病，急性心肌梗塞，I型糖尿病，肌营养失调，糖尿病足，闭塞性脉管炎，肝炎，肝硬化及肿瘤的治疗、化疗后的支持疗法，都涉及了干细胞应用。例如，大量的文献报道：由于慢性糖尿病人引起的慢性肢体缺血，在经过了骨髓干细胞的移植治疗后，将近半数的患者肢体出现缺血性溃疡或坏疽的改善，提示这些肢体治疗成功。而植入一种名为CD133的骨髓干细胞，终末期慢性缺血性心肌病患者的心功能则得到了明显改善。综合我们的经验和观察，自体骨髓干细胞在肝脏再生和肝纤维化的治疗中同样具有作用。德国多赛多夫的科学家发现骨髓干细胞对于参与肝脏再生起了一定的作用，治疗组的肝的增生速度，在经干细胞移植后，比对照组快了2.5倍，提示这种新的治疗方法在临床上具有提高和促进肝脏再生的潜能。综上所述，干细胞在生命科学领域内是当今的研究热点。在移植医学领域，由于同种供体的严重短缺，大量需要移植治疗的患者得不到及时救治，因此，异种动物和干细胞的应用就成为人们的希望。但多种原因造成异种移植未能取得突破性进展，而干细胞的研究则给各种疾病患者带来了曙光。骨髓干细胞移植已经运用于临床治疗患者，而干细胞研究的深入，使得运用干细胞生成可供移植的多种具有功能的组织和器官成为可能。细胞治疗目前可以治疗各种细胞损伤性疾病已经成为共识。开展新型干细胞分离试剂盒的研究具有广阔的市场应用前景。众所周知，传统的分离人类单细胞核的简单而有效的方法最初是由ArneBoyum在1968年报道的，25年来商品化的淋巴细胞分离液(LymphoprepTM又名Ficoll-Isopaque)已经广泛地用于单核细胞的分离。其基本原理在于单核细胞(单核细胞和淋巴细胞)同多行核淋巴细胞(颗粒细胞)和红细胞相比具有较轻的浮力密度。大多数单核细胞的浮力密度是低于1.077g/ml。这些细胞可以通过一种密度在1.077g/ml的等渗溶液来进行分离。通过离心，形成密度梯度，红细胞和多行核淋巴细胞沉淀，而单核细胞集中在分离液等密度的交界面处。普通淋巴细胞分离液的密度为1.077g/ml并且含有一种名为Polysaccharide的成分，可以促进红细胞聚集和分层。但这也带来了两个不利的地方：(1)Polysaccharide可以结合在淋巴细胞表面，影响细胞的分裂；(2)因为红细胞聚集，所以要进一步处理红细胞的团块儿就显得十分困难。运用淋巴细胞分离液分离单核细胞，需要非常仔细地将稀释的血液样品加在分离液上，并且要保持血样和分离液之间存在清晰的界面。要做到这一步，需要良好的训练并且对于大量的样品来讲是耗时的。在经过繁琐的分离后，将单核细胞在经过免疫磁珠的分离法或者流式细胞分离法来进行干细胞的分离。整个过程耗时昂贵，细胞损失严重，活力受到明显影响。
技术实现思路
针对现有技术中的缺陷，本专利技术的目的是提供一种人骨髓、脐带血、外周血干细胞分离试剂盒及其分离方法。本技术方案应用负选收集法，可以选择性地除去红细胞，血小板，全部血浆物质，成熟的血细胞及淋巴细胞；能够收集所有的lin阴性的干/祖细胞；不需要采用动员剂，无血浆残留；可以分离大容量骨髓、脐带血和外周血，细胞回收率达到了85％。尤其合适于脐带血库和临床抽取的骨髓、脐带血和外周血样品处理。本专利技术的试剂盒摒弃了将收集血样加入到本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种人骨髓、脐带血、外周血干细胞分离试剂盒，其特征在于，所述分离试剂盒中包括如下试剂：试剂A：氯化钠溶液；试剂B：含羟乙基淀粉、混合抗体的氯化钠溶液；试剂C：淋巴细胞分离液或碘克沙醇工作液。

【技术特征摘要】
1.一种人骨髓、脐带血、外周血干细胞分离试剂盒，其特征在于，所述分离试剂盒中包括如下试剂：试剂A：氯化钠溶液；试剂B：含羟乙基淀粉、混合抗体的氯化钠溶液；试剂C：淋巴细胞分离液或碘克沙醇工作液。2.根据权利要求1所述的人骨髓、脐带血、外周血干细胞分离试剂盒，其特征在于，所述氯化钠溶液为生理盐水。3.根据权利要求1所述的人骨髓、脐带血、外周血干细胞分离试剂盒，其特征在于，试剂B中，所述羟乙基淀粉在氯化钠溶液中的质量浓度为5-10％，所述混合抗体在氯化钠溶液中的浓度为4-12微克/毫升。4.根据权利要求3所述的人骨髓、脐带血、外周血干细胞分离试剂盒，其特征在于，所述试剂B是通过如下步骤制备而得：取混合抗体加入到羟乙基淀粉生理盐水溶液中，得到试剂B。5.根据权利要求4所述的人骨髓、脐带血、外周血干细胞分离试剂盒，其特征在于，所述混合抗体是通过如下步骤制备而得：S1、将质量比为1:3的抗体和抗血型糖蛋白A抗体混合均匀；S2、再加入P9抗体或者P9F(ab’)2抗体片段，37℃孵育过夜，使三者得到交联；所述P9抗体与抗体的质量比为4:1，所述P9F(ab’)2抗体片段与抗体的质量比为2.72:1。6.根据权利要求5所述的人骨髓、脐带血、外周血干细胞分离试剂盒，其特征在于，步骤S1中，所述抗体为抗CD2、抗CD3、抗CD14、抗CD16、抗CD19、抗CD24、抗CD5、抗CD66中的一种或几种。7.根据权利要求1所述的人骨髓、脐带血、外周血干细胞分离试剂盒，其特征在于，试剂C中，碘克沙醇工作液包括成分1和成分2；成分1组成：细胞悬浮培养液pH7.4、0.85％w/v氯化钠和10mmol/LTricine-NaOH；成分2组成：碘克沙醇注射液40％、0.85％w/v氯化钠和30mmol/LTricine-NaOH。8.根据权利要求7所述的人骨髓...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔大祥，汪铮，张倩，尹婷，
申请(专利权)人：上海交通大学，苏州康立达纳米生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31