基于SERS检测技术和微流控芯片的多种肿瘤标志物检测平台及方法技术

本发明专利技术公开了一种基于SERS检测技术和微流控芯片的多种肿瘤标志物检测平台，通过先在微流控通道内形成SERS衬底来提高检测的灵敏度，然后在SERS衬底上形成经典的三明治结构以检测待测试剂中是否含有特定的肿瘤标志物。通过先用PDMS芯片在衬底上连接上特定的捕获抗体，然后将新PDMS芯片的放置位置垂直于之前放置位置以达到在交叉区域可同时检测多种肿瘤标志物的作用。通过通入连接有二抗和拉曼报告分子的SERS免疫探针以达到定性以及定量探测待测试剂中肿瘤标志物的作用，二抗可放大信号，所以可以进一步的提高检测的灵敏度。整个平台可以同时定性定量检测多种肿瘤标志物，对癌症患者早期诊断出患有癌症并提高存活率提供了有利的技术支持。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于光谱学和生物分析
，具体涉及一种基于SERS检测技术和微流控芯片的多种肿瘤标志物检测平台及方法。
技术介绍
近年来，尽管目前人们越来越了解乳腺癌的演变过程，医疗方式也在不断的进步，但是乳腺癌患者的死亡率依然非常高。其中的一个原因就是乳腺癌患者被诊断出患有乳腺癌比较晚，所以提高乳腺癌患者的早期诊断准确性显得至关重要，这能提高乳腺癌患者的存活率。到目前为止，已经有大量的实验证明肿瘤标志物对于癌症早期诊断和监控有很大的潜力。然而只检测一种肿瘤标志物从而判断患者是否患有癌症是往往不准确的，同时检测多种肿瘤标志物能够增加癌症早期诊断的准确性。如同时检测三种乳腺癌肿瘤标志物(antigen15-3)CA153、(antigen12-5)CA125、(carcinoembryonicantigen)CEA能够提高乳腺癌诊断的准确性已经被证明，所以我们需要一个平台能够同时检测多种肿瘤标志物。目前对于癌症肿瘤标志物的检测主要有SERS、ELISA、LSPR、SPR、RIA、CLEIA等等。由于标志物在早期癌症患者体内的含量很少，如乳腺癌肿瘤标志物(CA153<30u/mlCA125<35u/mlCEA≤5.9ng/ml)，而SERS能够提高探测的灵敏度，所以使用SERS检测技术。基于SERS的检测方法主要分为无标和有标检测，无标探测是指生物分子被直接的检测，而有标检测为使用连接上拉曼报告分子的探针间接的检测目标分子。由于有标检测相比无标检测能大幅度的提高检测的灵敏度，所以有标检测方法被采用。近年来，由于微流控芯片具有液体流动可控、消耗试样和试剂极少、分析速度成十倍上百倍地提高，以及可以在几分钟甚至更短的时间内进行上百个样品的同时分析，并且可以在线实现样品的预处理及分析全过程等的优点，使得基于微流控芯片进行DNA、蛋白质等微量物质的探测得到了越来越广泛的应用。于此同时微流控芯片由于其体积小便于集成，使用样品和试剂少的同时还能获得高通道，试剂在微流控通道内反应速度快等特点以及在生物、化学、医学等领域获得了大量的使用。考虑到实际应用中的便携性和患者样品量少等原因，我们选用了PDMS芯片。
技术实现思路
专利技术目的：为了克服现有技术中存在的不足，提高早期癌症诊断的准确性和灵敏度，本专利技术提供一种基于SERS检测技术和微流控芯片的多种肿瘤标志物检测平台，能同时检测多种肿瘤标志物并能提高检测灵敏度，可以极大的增强肿瘤标志物的检测灵敏度，为早期癌症的诊断提供有力的技术支持。技术方案：为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种基于SERS检测技术和微流控芯片的多种肿瘤标志物检测平台，包括由微流控芯片制成的微流控通道及其内的SERS衬底，以及SERS探针和探测抗体；所述微流控通道为十字交叉形，横向通道内为所述SERS衬底，垂直的纵向通道内通入所述SERS探针和探测抗体，交叉区域即为检测区域；所述SERS衬底由金属纳米粒子通入所述微流控通道内得到，所述SERS衬底上连接有捕获抗体；所述SERS探针由金属纳米粒子分别与拉曼报告分子、二抗连接，然后用BSA进行金属表面空隙的填补制成。进一步的，所述微流控芯片为PDMS芯片。进一步的，所述捕获抗体不少于两种。一种基于SERS检测技术和微流控芯片的多种肿瘤标志物检测平台的方法，包括以下步骤：首先，制备SERS探针：步骤1).制备金属纳米粒子；步骤2).在步骤1)中得到的金属纳米粒子表面接上拉曼报告分子；步骤3).在步骤2)中将连接有拉曼报告分子的金属纳米粒子表面连接上捕获抗体；步骤4).在步骤3)后使用BSA填补金属纳米粒子表面的空隙形成SERS探针；其次，制备SERS衬底：步骤5).将PDMS芯片贴合在羟基化的玻璃片上，形成微流控通道；步骤6).向所述微流控通道内通入带正电的溶液；步骤7).将步骤1)中的金属纳米粒子通入所述微流控通道内，得到SERS衬底；步骤8).重复步骤6)和步骤7)两到三次，形成多层SERS衬底；步骤9).在步骤8)得到的SERS衬底上连接上捕获抗体；步骤10).在步骤9)的基础上通入BSA进行填补金属表面空隙；然后，抗体检测：步骤11).取下PDMS芯片等待玻璃表面干燥后，在与原来PDMS芯片垂直的方向贴合上新的PDMS芯片；步骤12).在步骤11)的基础上通入BSA；步骤13).在步骤12)后进一步向新的微流通道内通入待测溶液；步骤14).在步骤13)的基础上向新的微流控通道内通入与步骤9)对应的探测抗体；步骤15).在步骤14)后将步骤4)所制备的SERS探针通入到新的微流控通道内；最后，SERS光谱成像：步骤16).对步骤11)所形成的通道交叉区域进行SERS光谱成像。进一步的，所述步骤2)、3)、4)、9)、10)、12)中的拉曼报告分子、捕获抗体、BSA通过化学键插入到金属纳米粒子表面。进一步的，所述步骤6)、7)、8)、9)、10)、12)、13)、14)、15)中向微流控通道内通入试剂的方法为通过注射泵将装有试剂的注射器中的试剂通过PE管连接钢针，然后钢针插入到所述微流控通道内的方式注射，通过调注射泵参数控制注射的试剂量和注射速率。进一步的，所述步骤7)中的所述SERS衬底是利用静电吸附的原理形成。进一步的，所述步骤13)和步骤14)中，待测溶液中的肿瘤标志物与捕获抗体间的连接为抗原和抗体间的特异性识别。进一步的，所述步骤15)中所述SERS探针与探测抗体的识别为SERS探针上的二抗与所述探测抗体的特异性识别。进一步的，所述步骤13)～16)中所述待测试剂中若含有肿瘤标志物，则通入探测抗体，会形成“三明治”结构；继续通SERS探针，即可检测该“三明治”结构是否已形成。有益效果：本专利技术提供的基于SERS检测技术和微流控芯片的多种肿瘤标志物检测平台，具有以下优点：1、所设计的平台可以同时检测多种肿瘤标志物，提高癌症早期诊断的准确性；2、所设计的平台所使用的SERS衬底可以提高检测的灵敏度；3、所设计的平台在抗体-抗原-抗体形成“三明治”结构的基础上通过连接有二抗的SERS探针进行探测，由于二抗可以检测一抗的存在并放大信号，并且和SERS技术联用可以极大的增加检测的灵敏度。4、由于与肿瘤标志物相关的抗体价格相对都较高，而二抗普遍价格较低，所以二抗的使用可以在达到较高检测灵敏度的同时节约成本。5、所设计的平台由于微流控芯片的使用，使得使用样品和试剂少的同时还能获得高通量，并且试剂在微流控通道内反应时具有反应速度快等特点。6、所设计的平台尺寸小巧便于携带和集成。附图说明图1为本专利技术检测原理示意图；图2为本专利技术所设计的一种同时检测多种肿瘤标志物示意图。具体实施方式下面结合附图对本专利技术作更进一步的说明。如图1所示为一种基于SERS检测技术和微流控芯片的多种肿瘤标志物检测平台，本专利技术为一种基于表面增强拉曼散射(SERS)检测技术和微流控芯片能同时检测多种肿瘤标志物并能提高检测灵敏度的平台，该平台通过先在微流控通道内形成SERS衬底来提高检测的灵敏度，然后在SERS衬底上形成经典的“三明治”结构以检测待测试剂中是否含有特定的肿瘤标志物。通过先用PDMS芯片在衬底上连接上特定的捕获抗体，然后将新的PDMS芯片的放置位置垂直于之前的放置本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于SERS检测技术和微流控芯片的多种肿瘤标志物检测平台，其特征在于：包括由微流控芯片制成的微流控通道及其内的SERS衬底，以及SERS探针和探测抗体；所述微流控通道为十字交叉形，横向通道内为所述SERS衬底，垂直的纵向通道内通入所述SERS探针和探测抗体，交叉区域即为检测区域；所述SERS衬底由金属纳米粒子通入所述微流控通道内得到，所述SERS衬底上连接有捕获抗体；所述SERS探针由金属纳米粒子分别与拉曼报告分子、二抗连接，然后用BSA进行金属表面空隙的填补制成。

【技术特征摘要】
1.一种基于SERS检测技术和微流控芯片的多种肿瘤标志物检测平台，其特征在于：包括由微流控芯片制成的微流控通道及其内的SERS衬底，以及SERS探针和探测抗体；所述微流控通道为十字交叉形，横向通道内为所述SERS衬底，垂直的纵向通道内通入所述SERS探针和探测抗体，交叉区域即为检测区域；所述SERS衬底由金属纳米粒子通入所述微流控通道内得到，所述SERS衬底上连接有捕获抗体；所述SERS探针由金属纳米粒子分别与拉曼报告分子、二抗连接，然后用BSA进行金属表面空隙的填补制成。2.根据权利要求1所述的基于SERS检测技术和微流控芯片的多种肿瘤标志物检测平台，其特征在于：所述微流控芯片为PDMS芯片。3.根据权利要求1所述的基于SERS检测技术和微流控芯片的多种肿瘤标志物检测平台，其特征在于：所述捕获抗体不少于两种。4.一种基于SERS检测技术和微流控芯片的多种肿瘤标志物检测平台的方法，其特征在于：包括以下步骤：首先，制备SERS探针：步骤1).制备金属纳米粒子；步骤2).在步骤1)中得到的金属纳米粒子表面接上拉曼报告分子；步骤3).在步骤2)中将连接有拉曼报告分子的金属纳米粒子表面连接上捕获抗体；步骤4).在步骤3)后使用BSA填补金属纳米粒子表面的空隙形成SERS探针；其次，制备SERS衬底：步骤5).将PDMS芯片贴合在羟基化的玻璃片上，形成微流控通道；步骤6).向所述微流控通道内通入带正电的溶液；步骤7).将步骤1)中的金属纳米粒子通入所述微流控通道内，得到SERS衬底；步骤8).重复步骤6)和步骤7)两到三次，形成多层SERS衬底；步骤9).在步骤8)得到的SERS衬底上连接上捕获抗体；步骤10).在步骤9)的基础上通入BSA进行填补金属表面空隙；然后，抗体检测：步骤11).取下PDMS芯片等待玻璃表面干燥后，在与原来PDMS芯片垂直的方向贴合上新的PDMS芯片；步骤12).在步骤11)的基础上通入BSA；步骤13).在步骤...

【专利技术属性】
技术研发人员：王著元，郑志华，崔一平，伍磊，宗慎飞，
申请(专利权)人：东南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32