引物对及其在巴戟天种质鉴定中的应用制造技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，尤其涉及引物对及其在巴戟天种质鉴定中的应用。本发明专利技术提供了核苷酸序列为SEQ ID NO:1～2和SEQ ID NO:3～4所示的引物对，并提供了这些引物对在巴戟天种质鉴定中的应用。采用本发明专利技术提供的引物对可仅通过PCR的方式对巴戟天进行鉴定，利用巴戟天叶绿体基因组中的特异性序列，能够实现对巴戟天的准确快速鉴定。从而能够从分子生物学的层面，实现对巴戟天属几种形态学相近物种的鉴别。进而避免了市场流通中巴戟天仿冒品的混入，提高了成品药的品质与用药安全性。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，尤其涉及引物对及其在巴戟天种质鉴定中的应用。
技术介绍
巴戟天(MorindaofficinalisHow)为茜草科植物，别名鸡肠风、鸡眼藤、黑藤钻、兔仔肠、三角藤、糠藤，主产于广东、福建、广西和海南。巴戟天以根部入药，性甘，味辛，微温；归肾、肝经；具有补肾阳，强筋骨，祛风湿的作用。用于阳痿遗精，宫冷不孕，月经不调，少腹冷痛，风湿痹痛，筋骨痿软。巴戟天作为常用中药之一始载于《神农本草经》列为上品，此后历代本草均有记载。梁·陶弘景在《本草经集注》中对该生药有简单的描述：“状如牡丹而细，外赤内黑，用之打去心”。巴戟天是我国著名的“四大南药”之一，其野生资源已近枯竭，在《中国植物红皮书—稀有濒危植物》一书中被列为三级保护植物。野生巴戟天多生长在茂密的树林中，荫蔽度比较大，而栽培巴戟天多种植于坡度较小的山坡上，多有小乔木或灌木遮阴。野生巴戟天由于长期处于野生状态，经受了各种灾害和不良环境的自然选择，往往保存了一般栽培种所不具有或已消失的某些重要特性，而栽培巴戟天在栽培过程中形成了多种农家类型。另外，与巴戟天形态相似的还有海巴戟(MorindacitrifoliaL.)、鸡眼藤(MorindaparvifoliaBartl.)、南岭鸡眼藤(MorindananlingensisY.Z.Ruan)等，这些植物同属巴戟天属，形态特征与巴戟天也极为相似，然而药用价值却与巴戟天存在较大差异。仅靠肉眼很难将巴戟天与海巴戟、鸡眼藤、南岭鸡眼藤区分，因此对巴戟天种质资源及其近缘种的研究成为了当务之急。叶绿体是植物进行光合作用特有的细胞器，为植物提供能量的主要来源，叶绿体拥有自己的基因组。完整的叶绿体基因组一般包含四个部分，大单拷贝区(LSC)、小单拷贝区(SSR)和两段反向重复区(IR)。叶绿体基因组的进化速率在核基因组和线粒体基因组的进化速率之间。早期的叶绿体基因组测序比较复杂，随着新一代测序技术的发展，为叶绿体基因组的研究提供了很大的便利。叶绿体基因组是追溯叶绿体起源与演化历程的重要信息来源。通过比较进化基因组学分析，可以确定在叶绿体演化过程中，哪些基因发生了丢失，哪些基因转移到了核基因组，推断基因丢失和转移的根源。叶绿体基因组分析是解决植物系统发育难题的重要途径。叶绿体基因组可以提供基因组结构和DNA序列两个层次的数据用于系统发育分析，对某些疑难系统发育问题的解决提供了关键证据。叶绿体基因组还可以用来为物种鉴定提供重要理论依据。但目前，尚未有针对巴戟天叶绿体基因组进行种植鉴定的相关报道。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术要解决的技术问题在于提供引物对及其在巴戟天种质鉴定中的应用。本专利技术提供的引物对能够实现对巴戟天种质的快速、准确鉴定。本专利技术提供了如SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对。本专利技术提供了如SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的引物对。本专利技术提供的引物对根据巴戟天叶绿体基因组特异性区域设计，该区域与相近物种的叶绿体基因组相比变异性较高，对该区域进行检测，能够实现对巴戟天种质的快速、准确鉴定。如SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对的退火温度为56℃。如SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的引物对的退火温度为56℃。本专利技术提供的引物对在巴戟天种质鉴定中的应用。本专利技术提供的引物对能够鉴别巴戟天，特别是能够从形态学特征相近的多种巴戟天属植物中鉴别出巴戟天。所述形态学特征相近的巴戟天属植物包括：巴戟天，鸡眼藤，海巴戟和南岭鸡眼藤。本专利技术还提供了一种巴戟天种质鉴定试剂盒，包括本专利技术提供的引物对。本专利技术提供的该试剂盒中还包括PCR试剂。所述PCR试剂可为分装的dNTP、TaqDNA聚合酶、Mg2+、扩增缓冲液。作为优选，PCR试剂为Taq酶预混液。本专利技术提供的试剂盒中还包括电泳试剂。所述电泳试剂包括琼脂和染料。所述染料为溴酚蓝和二甲苯青。本专利技术提供的试剂盒中还包括DNA分子标记。作为优选，DNA分子标记中包括不同分子量的DNA分子。本专利技术实施例中，DNA分子标记中，包括分子量为分别为4500bp、3000bp、2000bp、1200bp、800bp、500bp和200bp的DNA分子。本专利技术提供的试剂盒中还包括PCR反应管。本专利技术还提供了一种巴戟天种质鉴定方法，以待测样品的基因组DNA为模板，分别以SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对、SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的引物对为引物进行PCR扩增；扩增获得片段的长度或序列满足以下条件之一，则该样品为巴戟天；以SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的长度为1349bp；以SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的序列如SEQIDNO:5所示；以SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的长度为905bp；以SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的序列如SEQIDNO:6所示。本专利技术中，待测样品为巴戟天，鸡眼藤，海巴戟或南岭鸡眼藤。扩增获得片段的长度或序列满足以下条件之一，则该样品为鸡眼藤；以SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的长度为1366bp；以SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的序列如SEQIDNO:7所示；以SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的长度为818bp；以SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的序列如SEQIDNO:8所示。扩增获得片段的长度或序列满足以下条件之一，则该样品为海巴戟；以SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的长度为779bp；以SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的序列如SEQIDNO:9所示；以SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的长度为892bp；以SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的序列如SEQIDNO:10所示。扩增获得片段的长度或序列满足以下条件之一，则该样品为南岭鸡眼藤；以SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的长度为1282bp；以SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的序列如SEQIDNO:11所示；以SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的长度为836bp；以SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的引物对扩增获得片段的序列如SEQIDNO:12所示。实际操作中，为了节省鉴定成本，采用电泳的方式对结果进行鉴定。优选为琼脂糖凝胶电泳。本专利技术一个实施例中，巴戟天种质鉴定方法为，以待测样品的基因组DNA为模板，可先以SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对对待测样品的基因组DNA进行扩增，若所得片段大小为779bp则鉴定为海巴戟，若所得片段大小为1282bp则鉴定为南岭鸡眼藤；若所得片段大小为1349bp～1366bp，难以通过肉眼对琼脂糖凝胶电泳结果进行分辨，则进一步以SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的引物对对待测样品的基因组DNA进行扩增，如所得片段大小为905bp则鉴定为巴戟天，若所得片段大小为818bp则鉴定为鸡眼藤。待测样品DNA为基因组DNA。其提取采用植物基因组DNA提取试剂盒。本文档来自技高网...

【技术保护点】
如SEQ ID NO:1～2所示核苷酸序列的引物对。

【技术特征摘要】
1.如SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对。2.如SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的引物对。3.权利要求1～2所述的引物对在巴戟天种质鉴定中的应用。4.一种巴戟天种质鉴定试剂盒，其特征在于，包括权利要求1～2所述的引物对。5.根据权利要求4所述的巴戟天种质鉴定试剂盒，其特征在于，其中还包括PCR试剂。6.根据权利要求4或5所述的巴戟天种质鉴定试剂盒，其特征在于，其中还包括电泳试剂。7.一种巴戟天种质鉴定方法，其特征在于，以待测样品的基因组DNA为模板，分别以SEQIDNO:1～2所示核苷酸序列的引物对、SEQIDNO:3～4所示核苷酸序列的引物对为引物进行PCR扩增；所述扩增获得片段的长度或序列...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦垂新，丁平，孙恬，姚松君，马务迢，刘伟贤，刘凤松，覃婕媛，王超，
申请(专利权)人：无限极中国有限公司，
类型：发明
国别省市：广东;44