同型半胱氨酸的测定试剂及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种同型半胱氨酸测定试剂及制备方法，属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料技术领域。由R1a试剂、R1b试剂、R2试剂和标准样构成，R1a试剂是由Triton X‑100溶解于添加有缓冲液、二硫苏糖醇的纯化水中所形成的溶液；R1b试剂是由基因重组蛋氨酸裂解酶溶解于添加有缓冲液、山梨醇、蔗糖、海藻糖、4‑氨基‑N,N‑二甲基苯胺盐酸盐的纯化水中所形成的溶液；R2试剂是添加有盐酸、三氯化铁的纯化水中所形成的溶液；标准样是由同型半胱氨酸、牛血清蛋白、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。将发明专利技术应用于同型半胱氨酸的测定，具有快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好等优点。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种同型半胱氨酸的测定试剂及其制备方法，属于借助于测定材料的化学或物理性质来测试或分析材料

技术介绍
同型半胱氨酸(高半胱氨酸,Hcy)是含硫氨基酸，在细胞内蛋氨酸脱甲基生成。同型半胱氨酸经甲基化生成蛋氨酸，此过程需活性维生素B12及四氢叶酸作为辅助因子参与。同型半胱氨酸也可经转硫通路生成半胱氨酸，此过程需胱硫酶合成酶参与，磷酸吡哆醛(活性维生素B6)为其辅助因子。当同型半胱氨酸代谢受阻，同型半胱氨酸就在细胞内积聚，并进入血液循环。还原型同型半胱氨酸在血中仅占1％，大部分以氧化型存在，其中80-90％与蛋白结合，5-10％与同型半胱氨酸自身结合(HCY-SS-HCY)，另外5-10％与半胱氨酸等结合形成混合型同型半胱氨酸二硫化物(CY-SS-HCY)。通常测定血中总同型半胱氨酸含量(tHCY)，临床证明：同型半胱氨酸对预测心脑血管病、恶性肿瘤、老年性痴呆等多种疾病的发病危险具有重要意义，具体如下：(1)同型半胱氨酸与冠状动脉疾病在动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管病症中，其血清同型半胱氨酸的水平显著升高，浓度越高危险性越大。所以轻微到中度同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化所致心血管疾病最广泛、最强的独立的致病因素。对慢性肾病病人，排泄HCY功能降低，血中tHCY增加，引起动脉粥样硬化，心血管疾病死亡率增加。(2)同型半胱氨酸与血栓形成同型半胱氨酸通过产生超氧化物及过氧化物损伤血管内皮细胞，改变凝血因子功能，增加血栓形成倾向。同型半胱氨酸可使小动脉血管易于栓塞及促进血管平滑肌细胞增殖参与粥样硬化形成。同型半胱氨酸活化形式(Homocysteinthiolactone)可促使血小板聚集，并可与载脂蛋白B形成致密的复合物易于被血管壁巨噬细胞吞噬，引起血管壁脂肪堆积。同型半胱氨酸能增强其它心血管疾病危险因素如胆固醇、高血压及吸烟对心血管的损害。(3)同型半胱氨酸与肾功能衰竭进行血液透析的肾病患者，其血中同型半胱氨酸水平可达到正常人的2～4倍，且发生血管栓塞性症状的几率显著增加。(4)同型半胱氨酸与妊娠同型半胱氨酸与与妊娠高血压综合症相关，妊娠中期同型半胱氨酸水平可作为早期妊娠高血压综合症的指标；在体外研究发现，高浓度的同型半胱氨酸具有胚泡毒性，从而导致畸胎发病率增加；高浓度同型半胱氨酸还可引起绒毛膜绒毛细胞血管病因而导致复发性早期流产。(5)遗传和营养因素所致高同型半胱氨酸血症同型半胱氨酸在体内的分解代谢，受两方面因素影响最大。一是与先天遗传有关的某些生物酶的缺乏，另一个就是体内叶酸、维生素B6、维生素B12等营养元素的缺乏。这两种缺乏都会影响同型半胱氨酸转化为其他物质，导致高同型半胱氨酸血症。目前国内测定同型半胱氨酸的方法主要有：(1)质谱法，该方法操作复杂，价格昂贵，不易开展。(2)胶乳增强免疫比浊法，该方法灵敏度较低，易产生带现象。(3)酶循环法，该方法虽然准确性高，但有干扰物的影响。例如：胆红素加入浓度在4.0mg/dl、8.0mg/dl、12.0mg/dl、16.0mg/dl、和20.0mg/dl时，产生的干扰偏差分别为-0.85％、0.51％、0.17％、-1.24％和-1.41％；血红蛋白加入浓度在3.3g/L、6.7g/L、10.0g/L、11.7g/L和13.3g/L时，产生的干扰偏差分别为4.49％、5.09％、6.55％、4.71％和6.71％；而荧光法中，胆红素、血红蛋白对该试剂盒的测定结果无明显干扰基于此，做出本申请。
技术实现思路
针对现有同型半胱氨酸在测试过程中存在的上述缺陷，本专利技术首先提供一种快速灵敏、准确性好、特异性高、稳定性好、液体双试剂操作简便，采用国内外先进的荧光法，适用于临床全自动或半自动生化分析(手工加样品、试剂)的同型半胱氨酸测定试剂。为实现上述目的，本申请采取的技术方案如下：一种同型半胱氨酸的测定试剂，由R1a试剂、R1b试剂、R2试剂和标准样构成，所述的R1a试剂是由TritonX-100溶解于添加有缓冲液、二硫苏糖醇(DTT)的纯化水中所形成的溶液；所述的R1b试剂是由基因重组蛋氨酸裂解酶溶解于添加有缓冲液、山梨醇、蔗糖、海藻糖、4-氨基-N,N-二甲基苯胺盐酸盐的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂是添加有盐酸、三氯化铁的纯化水中所形成的溶液；所述的标准样是由同型半胱氨酸、牛血清蛋白、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。进一步的，作为优选：所述的R1a试剂中，缓冲液为三羟甲基氨基甲烷(Tris)，更优选的，所述的三羟甲基氨基甲烷(Tris)的浓度为100mmol/L，二硫苏糖醇(DTT)的浓度为0.5mmol/L，TritonX-100的浓度为0.2％。所述的R1b试剂中，山梨醇的浓度3％，蔗糖的浓度为2％，海藻糖的浓度为2％，4-氨基-N,N-二甲基苯胺盐酸盐浓度为20mmol/L，基因重组蛋氨酸裂解酶浓度为0.75KU/L。所述的R2试剂中，盐酸浓度为10％，三氯化铁浓度为15mmol/L。所述的标准样中，缓冲液为磷酸盐缓冲液，更优选的，所述的磷酸盐缓冲液的浓度为50mmol/L，牛血清蛋白浓度为0.5％，叠氮钠浓度为0.1％。同时，本申请还提供了一种具有上述特征同型半胱氨酸测定试剂的制备方法，包括如下步骤：(1)R1a试剂配制：向纯化水中加入缓冲液，搅拌至完全溶解；加入二硫苏糖醇(DTT)搅拌至溶解，加入TritonX-100，搅拌至溶解，继续搅拌后定容；(2)R1b试剂配制：向纯化水中加入缓冲液，搅拌至完全溶解；加入山梨醇搅拌至溶解，加入蔗糖，搅拌至溶解；加入海藻糖，搅拌至溶解；加入4-氨基-N,N-二甲基苯胺盐酸盐，搅拌至溶解；加入基因重组蛋氨酸裂解酶搅拌至完全溶解，继续搅拌后定容；(3)R2试剂配制：向纯化水中加入盐酸，搅拌至完全溶解；加入三氯化铁，搅拌至溶解，继续搅拌后定容；(4)同型半胱氨酸标准样配制：向纯化水中加入同型半胱氨酸，搅拌至完全溶解；加入缓冲液搅拌至溶解，加入牛血清蛋白搅拌至溶解；加入叠氮钠搅拌至完全溶解；继续搅拌后定容；(5)对上述制备的R1a试剂、R1b试剂和R2试剂及同型半胱氨酸标准样进行灵敏度、线性范围、精密度和准确度进行测定。进一步的，作为优选：所述的搅拌速度为450转/分。搅拌速度过高会导致剪切力过大，影响所配制溶体的表面张力和粘合力，搅拌速度过低则影响其混配效果，控制在450转/分时，在确保搅拌剪切适中的同时，也促进了其内所添加物质的融合。步骤(1)中，所述的纯化水为400ml，定容体积为500ml。定容前后体积变化在20％左右，可以很好的保证其内所添加其他物质良好的融合性，确保所配置的R1a试剂浓度、溶液稳定性最佳。步骤(2)中，所述的纯化水为2ml，定容体积为3ml。定容前后体积变化在20％左右，可以很好的保证其内所添加其他物质良好的融合性，确保所配置的R1b试剂浓度、溶液稳定性最佳。步骤(3)中，所述的纯化水为80ml，定容体积为100ml。定容前后体积变化在20％左右，可以很好的保证其内所添加其他物质良好的融合性，确保所配置的R2试剂浓度、溶液稳定性最佳。步骤(4)中，所述的纯化水为80ml，定容体积为100ml。定容前后体积变化在20％左右，本文档来自技高网...

【技术保护点】
同型半胱氨酸的测定试剂，其特征在于：由R1a试剂、R1b试剂、R2试剂和标准样构成，所述的R1a试剂是由Triton X‑100溶解于添加有缓冲液、二硫苏糖醇的纯化水中所形成的溶液；所述的R1b试剂是由基因重组蛋氨酸裂解酶溶解于添加有缓冲液、山梨醇、蔗糖、海藻糖、4‑氨基‑N,N‑二甲基苯胺盐酸盐的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂是添加有盐酸、三氯化铁的纯化水中所形成的溶液；所述的同型半胱氨酸标准样是由同型半胱氨酸、牛血清蛋白、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。

【技术特征摘要】
1.同型半胱氨酸的测定试剂，其特征在于：由R1a试剂、R1b试剂、R2试剂和标准样构成，所述的R1a试剂是由TritonX-100溶解于添加有缓冲液、二硫苏糖醇的纯化水中所形成的溶液；所述的R1b试剂是由基因重组蛋氨酸裂解酶溶解于添加有缓冲液、山梨醇、蔗糖、海藻糖、4-氨基-N,N-二甲基苯胺盐酸盐的纯化水中所形成的溶液；所述的R2试剂是添加有盐酸、三氯化铁的纯化水中所形成的溶液；所述的同型半胱氨酸标准样是由同型半胱氨酸、牛血清蛋白、缓冲液和叠氮钠溶解于纯化水中形成的溶液。2.如权利要求1所述的同型半胱氨酸的测定试剂，其特征在于：所述的R1a试剂中，缓冲液为三羟甲基氨基甲烷。3.如权利要求1所述的同型半胱氨酸的测定试剂，其特征在于：所述的R1b试剂中，山梨醇的浓度3%，蔗糖的浓度为2%，海藻糖的浓度为2%，4-氨基-N,N-二甲基苯胺盐酸盐浓度为20mmol/L，基因重组蛋氨酸裂解酶浓度为0.75KU/L。4.如权利要求1所述的同型半胱氨酸的测定试剂，其特征在于：所述的R2试剂中，盐酸浓度为10%，三氯化铁浓度为15mmol/L。5.如权利要求1所述的同型半胱氨酸的测定试剂，其特征在于：所述的标准样中，缓冲液为磷酸盐缓冲液。6.如权利要求1-5任一项所述同型半胱氨酸测定试剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）R1a试剂配制：向纯化水中加入缓冲液，搅拌至完全溶解；加入二硫苏糖醇(DTT...

【专利技术属性】
技术研发人员：方朝君，
申请(专利权)人：浙江达美生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33