本发明专利技术具体公开了一种猫弓形虫血清抗体的Dot‑ELISA快速检测试剂盒,本试验将硝酸纤维素膜(NC)打孔后固定于96孔板内,将弓形虫SAG3蛋白包被于NC膜上,加入待检抗体与其发生反应,再通过加入酶标二抗使其形成抗原‑抗体复合物。加入显色液,终止反应后对结果进行判断。如NC膜上斑点呈棕色则判定为阳性,无颜色变化的判定为阴性。应用重组抗原包被NC膜可延长保存时间。膜片可拆开单独保存,避免了NC膜的污染。本发明专利技术具有较高的灵敏性和特异性,不需要特殊的仪器,可进行大规模的血清样品的筛选,实际应用价值较大。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术具体公开了一种猫弓形虫血清抗体的Dot-ELISA快速检测试剂盒,同时进一步提供了猫弓形虫血清抗体的Dot-ELISA快速检测试剂盒的制备方法,属于寄生虫检测方法
技术介绍
弓形虫(Toxoplasmosis)是一种专性细胞内寄生的寄生虫,该病的宿主较为广泛,其中猫及猫科动物是该病的终末宿主。猫是自然界感染该病最普遍的动物,同时也是人类感染该病的重要的传染源。人群中免疫功能异常者,通常会出现继发疾病甚至造成患者死亡。孕妇感染弓形虫后,会出现流产、早产、产死胎等情况。目前主要用于检测弓形虫抗体的方法有:补体结合试验(CT),间接血凝试验(IHA),乳胶凝集试验(LAT),碳粒凝集试验(CAT),间接免疫荧光试验(IFA),酶联免疫吸附试验(ELISA)等。Dot-ELISA是在常规ELISA的基础之上,以NC膜代替聚乙烯酶标板而建立起的一种免疫学检测方法。Dot-ELISA不但保留了常规ELISA的优点,还克服了常规ELISA抗原-抗体结合不牢固等缺点。常规ELISA方法检测,结果的判断需要借助仪器(酶标仪)。Dot-ELISA方法不需要借助仪器,只需肉眼观察,结果通过斑点颜色的出现和色泽深浅进行判定。Dot-ELISA灵敏性和特异性均高于常规ELISA,试验所需材料易获得、体积较小、可长期保存。这些特点为其以后的推广提供了可能。
技术实现思路
本专利技术公开了一种猫弓形虫血清抗体的Dot-ELISA快速检测试剂盒,具有较高的灵敏性和特异性,不需要特殊的仪器,可进行大规模的血清样品的筛选,实际应用价值较大。本专利技术将硝酸纤维素膜(NC)打孔后固定于96孔板内,将弓形虫SAG3蛋白包被于NC膜上,加入待检抗体与其发生反应,再通过加入酶标二抗使其形成抗原-抗体复合物。加入显色液,终止反应后对结果进行判断。如NC膜上斑点呈棕色则判定为阳性,无颜色变化的判定为阴性。应用重组抗原包被NC膜可延长保存时间。膜片可拆开单独保存,避免了NC膜的污染。本专利技术所述的检测弓形虫血清抗体的间接Dot-ELISA试剂盒,其特征在于主要由以下部分组成:主要包括包被抗原、包被液、封闭液、样品稀释液及洗涤液、辣根过氧化物酶标记的二抗、底物显色液、试验终止液、阳性参照血清、阴性参照血清、96孔可拆聚苯乙烯塑料反应板等。包被抗原为弓形虫表面蛋白SAG3(蛋白浓度为1.2μg/μL);包被液为0.05M碳酸盐缓冲液PH(9.6);封闭液为5%的脱脂奶粉;样品稀释液及洗涤液为0.5%Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBST);辣根过氧化物酶标记的二抗为山羊抗猫IgG;底物显色液为TMB溶液;终止液为2mol/L的硫酸溶液(H2SO4);阳性参照血清及阴性参照血清。本专利技术所述的检测猫弓形虫血清抗体的间接Dot-ELISA试剂盒的制备方法,包括以下步骤:1)将处理好的NC膜用打孔器裁成合适大小,固定于96孔板的底部;2)取2μL的SAG3蛋白包被在NC膜上,室温干燥或37℃温箱烘干,用50μL的5%的脱脂乳粉进行封闭,37℃温箱孵育1h;3)PBST洗板3次每次5min,加入待检血清50μL,37℃孵育1h;4)PBST洗板3次每次5min,加入酶标二抗50μL,37℃孵育1h;5)PBST洗板3次每次5min,加入DAB显色液50μL,避光显色10-30分钟,随时观察颜色变化。加入蒸馏水终止反应。本专利技术与现有技术相比,有益的效果在于:将NC膜裁剪成固定大小的膜片,利用重组蛋白对膜片进行包被,这样可以避免使用特殊仪器,具有省时、便捷的特点。本专利技术用斑点酶联免疫吸附法与常规酶联免疫吸附法进行比较,结果表明斑点酶联免疫吸附法的灵敏性高于常规方法。因其灵敏度较好进而试验的准确度较高。本专利技术利用重组抗原包被NC膜,作为抗原的一种干燥保存形式,可延长抗原的保存时间。本专利技术所用材料的成本较低,便于企业的生产,经济效益将较为可本观;本方法检测效率较高,可进行大规模的市场推广。对临床进行猫弓形虫病的普查具有较大的参考价值。附图说明图1为最佳血清稀释度结果图;图2为最佳酶标二抗工作浓度结果图;图3为最佳抗原工作浓度结果图;图4为特异性试验结果图;图5为敏感性试验结果图。具体实施方式下列实施例旨在进一步举例说明,而不是限制本专利技术。实施例1间接Dot-ELISA前期样品的制备(1)NC膜用蒸馏水浸泡20min。制成合适大小的圆形膜片,干燥后放入96孔板中,包被蛋白,加入5%的脱脂乳粉;封闭时间为1h;洗涤3次每次5min。(2)抗原的制备:利用基因工程技术对弓形虫表面抗原SAG3基因进行表达、鉴定,最终获得弓形虫SAG3蛋白。(3)用微量移液器取抗原混合物在NC膜中间进行点样,干燥后,5%的脱脂乳粉进行封闭;封闭后将NC膜至于PBST中进行洗涤,得到重组抗原包被的NC膜,也可称之为快速诊断膜片。阴凉干燥处储存备用;一抗血清通过静脉采血后离心去上清;(4)二抗为过氧化物酶标记的山羊抗猫IgG;(5)将得到的抗原包被的NC膜置于96孔板中,每孔加入样品50μL,37℃温箱中孵育1h;(6)将NC膜置于PBST中进行洗涤,3次,每次5min;(7)加入HRP标记的山羊抗猫二抗IgG50μL每孔,37℃温箱孵育1h;(8)PBST进行洗涤3次,每次5min;(9)加入DAB显色液,避光显色。蒸馏水中进行终止。(10)结果判定,当NC膜上出现棕色斑点是可判定为阳性,无颜色变化判定为阴性。实施例2:间接Dot-ELISA方法的建立1、待检血清最佳稀释度取2μg弓形虫SAG3蛋白包被膜片,用PBST对阳性参照血清按1:100向后倍比稀释至1:25600,按实施例1进行试验,最终确定待检血清的最佳稀释度为1:1600。(见图1)2、HRP标记山羊抗猫IgG最佳工作浓度将HRP标记的山羊抗猫IgG按照1:1000倍比稀释至1:7000,按照实施例1进行试验,最终确定最佳工作浓度为1:5000。(见图2)3、包被抗原最佳工作浓度判断标准按照阳性与阴性参照血清A450的比值及膜片的显色程度进行判断,最佳的抗原包被量为0.125μg/孔。(见图3)4、性能的测定(1)敏感性试验将阳性参照血清由1:200倍比稀释至1:25600,观察膜片颜色变化,在阳性参照血清稀释至1:12800时,膜片仍有颜色,最终确定本试验的敏感性为1:12800。(见图4)(2)特异性试验猫弓形虫阳性及阴性参照血清、猫杯状病毒、猫传染性胃肠炎病毒进行试验,只有阳性参照血清出现颜色变化,其他未出现颜色变化。说明本试验方法特异性较强。(见图5)(3)重复性试验猫弓形虫参照血清进行不同批次的膜片的重复性试验,结果表明,本试验的重复性较好。4、样品检测间接血凝试验与间接Dot-ELISA试验检测猫血清96份,其中间接血凝试验检出54份阳性,间接Dot-ELISA检出60份阳性。实施例3检测猫弓形虫血清抗体间接ELISA试剂盒成份的组装检测试剂盒包括以下组分:1、弓形虫表面抗原SAG3蛋白(-20℃保存);2、包被液(0.05M碳酸盐缓冲液)PH(9.6):秤取NaCO31.59g;NaHCO32.93g;蒸馏水80mL,待其溶解后,调PH值9.6,定容至100mL;3、硝酸纤维素膜(NC)打孔后真空本文档来自技高网...
【技术保护点】
检测弓形虫血清抗体的间接Dot‑ELISA试剂盒,其特征在于主要由以下部分组成:主要包括包被抗原、包被液、封闭液、样品稀释液及洗涤液、辣根过氧化物酶标记的二抗、底物显色液、试验终止液、阳性参照血清、阴性参照血清、96孔可拆聚苯乙烯塑料反应板;包被抗原为弓形虫表面蛋白SAG3(蛋白浓度为1.2μg/μL);包被液为0.05M碳酸盐缓冲液PH(9.6);封闭液为5%的脱脂奶粉;样品稀释液及洗涤液为0.5% Tween‑20的磷酸盐缓冲液(PBST);辣根过氧化物酶标记的二抗为山羊抗猫IgG;底物显色液为TMB溶液;终止液为2mol/L 的硫酸溶液(H2SO4);阳性参照血清及阴性参照血清。
【技术特征摘要】
1.检测弓形虫血清抗体的间接Dot-ELISA试剂盒,其特征在于主要由以下部分组成:主要包括包被抗原、包被液、封闭液、样品稀释液及洗涤液、辣根过氧化物酶标记的二抗、底物显色液、试验终止液、阳性参照血清、阴性参照血清、96孔可拆聚苯乙烯塑料反应板;包被抗原为弓形虫表面蛋白SAG3(蛋白浓度为1.2μg/μL);包被液为0.05M碳酸盐缓冲液PH(9.6);封闭液为5%的脱脂奶粉;样品稀释液及洗涤液为0.5%Tween-20的磷酸盐缓冲液(PBST);辣根过氧化物酶标记的二抗为山羊抗猫IgG;底物显色液为TMB溶液;终止液为2mol/L的硫酸溶液(H2SO4);阳性参...
【专利技术属性】
技术研发人员:宫鹏涛,刘伟建,杨正涛,张西臣,寇金华,李建华,杨举,李赫,李棕松,
申请(专利权)人:吉林大学,
类型:发明
国别省市:吉林;22
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