一种植物染色体的滴片制备方法技术

本发明专利技术提供一种植物染色体的滴片制备方法，先将植物器官置于一氧化二氮气体中进行预处理，随后采用固定液对预处理后的植物器官进行固定处理，再采用酶对植物器官的细胞壁进行酶解，将酶解后的植物器官破碎并配制成细胞悬液，将细胞悬液滴加到载玻片或盖玻片上，制成植物染色体标本。本发明专利技术方法采用的试剂毒性低，处理获得的分裂相较常规制片法染色体呈圆形或椭圆形分散，分布均匀，染色体交叉少，分散度较好，能够获得比较完整的染色体，可制备质量稳定、染色清晰、分散度较好的染色体装片，制备的染色体装片可用于细胞学鉴定、永久装片的制作、原位杂交、显微切割和显微分离等。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于染色体制片
，具体涉及一种植物染色体的滴片制备方法。
技术介绍
染色体制片是进行染色体形态观察、原位杂交和染色体分离等的基础。染色体制片常用的方法主要有压片法和涂片法。但压片法和涂片法主要存在以下缺点：（1）实验药品毒性较大。压片法和涂片法一般以α-溴奈、8-羟基喹啉和秋水仙素等作为预处理的溶液，药品致癌性强；（2）处理时间偏长，一般预处理需要3-5个小时、固定处理1-2天，从取材到制片一般需要1.5-2.5天，处理时间长。且固定液现配现用，较为麻烦；（3）压片法和涂片法染色体的分散度有限，不便于对染色体进行相关操作（如原位杂交、单个染色体分离及染色体显微切割）；（4）压片法和涂片法容易破坏染色体，分离得到的染色体不完整。压片时会使用一定的力度使原生质体分开，这使细胞紧紧的贴合于盖玻片或载玻片，若要分离单个的细胞或者染色体就要进行揭片，揭片时不能使染色体完全附着于盖玻片或者载玻片，得到的是不完整的染色体。而涂片法在用解剖针将根尖细胞涂于玻片上时很容易破坏染色体，在烤片时高温也会破坏DNA。而随着分子生物学及细胞生物学的发展，在研究中，许多实验需要对染色体进行相关操作，如荧光原位杂交、单个染色体分离及染色体显微切割等，现有的染色体制片方法不适用于这些研究，存在一定的缺陷。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述不足，本专利技术要解决的技术问题是：针对现有的染色体制片方法实验药品毒性大、处理时间偏长、分散度有限且容易破坏染色体，不适用于现在分子和细胞生物学对染色体制片要求的技术问题，而提供一种毒性低、制片时间短、染色体分散度和完整性较好、适用于原位杂交、染色体分离和显微切割的植物染色体的滴片制备方法。为了解决上述技术问题，本专利技术采用如下技术方案：一种植物染色体的滴片制备方法，先将植物器官置于一氧化二氮气体中进行预处理，随后采用固定液对预处理后的植物器官进行固定处理，再采用酶对植物器官的细胞壁进行酶解，将酶解后的植物器官破碎并配制成细胞悬液，将细胞悬液滴加到载玻片或盖玻片上，制成植物染色体标本。本专利技术针对现有技术中植物染色体制片预处理时使用的试剂毒性大，且对染色体分散效果不好的技术问题，特通过研究创造性地提出采用一氧化二氮对植物进行预处理，一氧化二氮可以破坏植物纺锤丝，进而可以增加中期染色体数目，便于后期进行染色体观察，且采用这样的预处理方法处理后的植物细胞经酶解后，染色体更容易分散开，进而本专利技术采用滴片的方式制片，不需要施加过多的外力，仅靠滴加时的自然重力就可以使细胞破裂，获得呈圆形或椭圆形分散、分布均匀、染色体交叉少、分散度好的染色体标本，更容易进行单个染色体或细胞分离等生物学研究工作，克服了现有染色体制片方法中压片法容易使细胞紧贴于载玻片上进而无法进行得不到完整的染色体，涂片法使用的解剖针容易破坏染色体，且在烤片时高温也会破坏DNA结构，不利于染色体观察的技术问题。进一步，所述滴片方法具体包括如下步骤：1）将植物器官用水清洗后，置于压力为0.5~1个大气压的一氧化二氮气体中进行预处理2~3h；2）将步骤1）预处理后的植物器官用固定液固定处理2~3h；所述固定液为乙醇；3）将步骤2）固定处理后的植物器官用水清洗后，置于复合酶液中在37~42℃下酶解2~3h；其中，所述复合酶液为将质量浓度为4-6%的纤维素酶溶液和质量浓度为4-6%的果胶酶溶液按照1：1的体积比混合制得；4）使用乙醇对步骤3）酶解后的植物器官清洗至少2次；5）对步骤4）清洗后的植物进行至少2次离心清洗，每一次离心清洗步骤为向植物器官中加入乙醇并以5000~6000r/min的离心速度离心1~5min后弃去上清液；6）向步骤5）离心清洗后的植物器官中加入醋酸溶液并进行破碎处理，向破碎处理后的植物器官中补加醋酸溶液至植物器官与醋酸溶液的质量体积比为1g:50~100mL，制得细胞悬液；7）将步骤6）制得的细胞悬液滴加到载玻片或盖玻片，制得所述植物染色体标本。具体地，本专利技术将植物器官置于一氧化二氮气体中进行预处理，一氧化二氮气体破坏了纺锤丝，增加中期染色体数目，且使处理后的细胞经酶解后，染色体更容易分散开，对预处理后的染色体进行固定处理，使植物器官的细胞保持原有的形态和结构，且使细胞内各种物质成分产生不同的折光率，便于后续观察和鉴定，固定处理后采用纤维素酶和果胶酶复合酶液，对植物器官的细胞壁进行酶解，对酶解后的植物器官采用醋酸等软化溶剂对植物器官进行软化处理后进行破碎，配制成细胞悬液，将配制的细胞悬液采用滴加的方式制片，滴片时利用自然的重力使细胞破裂，获得整体呈圆形或椭圆形、分散度好的染色体标本，减少了对染色体的伤害，得到了比较完整的染色体，便于进行细胞学鉴定、永久装片的制作、原位杂交、显微切割和显微分离等研究。作为优化，步骤2）中所述固定液为质量浓度90%的醋酸水溶液。本专利技术采用质量浓度为90%的醋酸水溶液作为固定液，不仅对植物染色体具有良好的保持原有形态和结构的作用，且采用该固定液进行固定处理时间短，配制该固定液也更加方便，操作更加简单快捷。作为优化，步骤3）中所述纤维素酶溶液的溶剂为pH4.6的柠檬酸钠缓冲液，所述果胶酶溶液的溶剂为pH4.6的柠檬酸钠缓冲液。本专利技术采用柠檬酸钠缓冲液作为溶剂，可以保证酶解处理过程中酶解液的pH不易随着反应的进行而改变，维持了纤维素酶和果胶酶在酶解过程中始终处于最适反应pH范围内，使得酶解的效率更好，且本专利技术缓冲液的pH为酶的最适反应pH，保证酶解更加成分，细胞壁的酶解效果更好。作为又一优化，步骤7）中从载玻片或盖玻片上方20~30cm高度处将所述细胞悬液滴加到载玻片或盖玻片上。从距离载玻片这样的高度处将细胞悬液滴加，既避免了高度太矮而使得悬液在空中停留时间过短，重力不足以使细胞破裂或破碎不完全的问题，也避免了高度过高操作不方便且容易将滴加的悬液喷溅到载玻片以外区域，而使得载玻片上沾染细胞悬液过少的问题。作为优化，步骤4）和步骤5）中采用体积浓度为70%的乙醇水溶液对植物器官进行清洗和离心清洗。采用这样浓度的乙醇溶液进行清洗，既保证了清洗的效果好，又避免了使用浓度过大的乙醇溶液对染色体结构和形态造成不良影响的问题。作为又一优化，所述植物器官为植物根尖。有丝分裂多发生在植物的根尖细胞，在细胞遗传学研究中，研究根尖细胞的染色体最具有意义，植物根尖染色体多且密集，而采用现有的制片方法很难获得完整的根尖细胞染色体、观察存在问题，本专利技术方法首先能够保持根尖细胞内染色体原有的状态和形貌，且分离出的植物根尖染色体分散度好、无交叉、形态完整，可以更加准确地观察植物根尖有丝分裂的性质。作为另一优化，所述植物器官为玉米根尖。本专利技术对玉米根尖染色体的分散效果尤佳，更适用于对玉米根尖染色体的状况进行观察。相比现有技术，本专利技术具有如下有益效果：1、本方法采用一氧化二氮对植物器官进行预处理，可以破坏植物纺锤丝，进而可以增加中期染色体数目，便于后期进行染色体观察，且采用这样的预处理方法处理后的植物细胞经酶解后，染色体更容易分散开，进而本专利技术采用滴片的方式制片，不需要施加过多的外力，仅靠滴加时的自然重力就可以使下破裂，获得呈圆形或椭圆形分散、分布均匀、染色体交叉少、分散度好的染色体标本，更容易进行单个染色体或细胞分本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种植物染色体的滴片制备方法，其特征在于，先将植物器官置于一氧化二氮气体中进行预处理，随后采用固定液对预处理后的植物器官进行固定处理，再采用酶对植物器官的细胞壁进行酶解，将酶解后的植物器官破碎并配制成细胞悬液，将细胞悬液滴加到载玻片或盖玻片上，制成植物染色体标本。

【技术特征摘要】
1.一种植物染色体的滴片制备方法，其特征在于，先将植物器官置于一氧化二氮气体中进行预处理，随后采用固定液对预处理后的植物器官进行固定处理，再采用酶对植物器官的细胞壁进行酶解，将酶解后的植物器官破碎并配制成细胞悬液，将细胞悬液滴加到载玻片或盖玻片上，制成植物染色体标本。2.根据权利要求1所述植物染色体的滴片制备方法，其特征在于，具体包括如下步骤：1）将植物器官用水清洗后，置于压力为0.5~1个大气压的一氧化二氮气体中进行预处理2~3h；2）将步骤1）预处理后的植物器官用固定液固定处理2~3h；3）将步骤2）固定处理后的植物器官用水清洗后，置于复合酶液中在37~42℃下酶解2~3h；其中，所述复合酶液为将质量浓度为4~6%的纤维素酶溶液和质量浓度为4~6%的果胶酶溶液按照1：1的体积比混合制得；4）使用乙醇对步骤3）酶解后的植物器官清洗至少2次；5）对步骤4）清洗后的植物进行至少2次离心清洗，每一次离心清洗步骤为向植物器官中加入乙醇并以5000~6000r/min的离心速度离心1~5min后弃去上清液；6）向步骤5）离心清洗后的植物器官中...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈发波，李红艳，姚启伦，何莲，王武琼，邓丽，李玉洁，冉佐，
申请(专利权)人：长江师范学院，
类型：发明
国别省市：重庆;50