一种测定骨钙素含量的试剂盒及其测试方法技术

本发明专利技术公开了一种采用磁微粒化学发光法测定人血清中骨钙素(BGP)含量的试剂盒。试剂盒包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；其中抗试剂异硫氰酸荧光素标记的骨钙素包被抗体和碱性磷酸酶标记的骨钙素标记抗体；磁微粒试剂为磁微粒与羊抗FITC连接物。本发明专利技术将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，并且采用了一步法反应模式，使得检测灵敏度、精密性大大提高、检测范围扩大，反应时间大大缩短，从开始加样到检测结果，时间少于35min,明显快于同类试剂盒；并且可以在全自动化学发光仪上同时测定多个样本，实现骨钙素的高通量快速化测定，准确度高，特异性强，精确度和检测效率有了较大的提高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物化学
，具体涉及一种采用磁微粒化学发光法测定人体中骨钙素(BGP)含量的试剂盒。
技术介绍
骨钙素(Osteocalcin)又称骨γ-羧基谷氨酸蛋白(BoneG-GlaProtein,BGP),是一种酸性蛋白，此蛋白类为维生素K依赖性,含有三个γ羧基谷氨酸侧链，BGP中γ羧基谷氨酸对其生物学特性非常重要，羧化后的BGP才能同Ca2+结合，BGP是骨中最丰富的非胶原骨蛋白之一，普遍存在于所有脊椎动物的骨骼和牙质中，在成人骨中它约占胶原骨蛋白总量的25％，维生素K是合成BGP不可缺少的物质，其合成受1，25(OH)2D3的调节。使用维生素K拮抗剂，可使此蛋白在骨中的含量减少，但并不影响其脯氨酸的含量，也不影响骨的机械强度。骨钙素(Osteocalcin)是骨骼中含量最大的非胶原蛋白，由成骨细胞合成进入血液。血中半衰期4～5min，是反映成骨细胞活性最为敏感、特异的指标。骨钙素值随年龄的变化以及骨更新率的变化而不同。骨更新率越快，骨钙素值越高，反之降低。在原发性骨质疏松中，绝经后骨质疏松症是高转换型的，所以骨钙素明显升高；老年性骨质疏松症是低转换型的，因而骨钙素升高不明显。故可根据骨钙素的变化情况鉴别骨质疏松是高转换型的还是低转换型的。需注意的是甲旁亢性骨质疏松症中骨钙素升高明显。目前已知的骨钙素测定方法有放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶乳增强比浊法等。放射免疫法步骤繁琐，试剂价格昂贵，需使用配套的仪器且存在放射性污染。酶联免疫吸附法存在检测时间长、操作复杂、重复性差、不适于急诊和临床病人及时诊断的需要。胶乳增强免疫比浊法操作简单、快速，但是灵敏度低、低值重复性差。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种准确度高的采用磁微粒化学发光法测定人血清中骨钙素(BGP)含量的试剂盒。为了解决上述技术问题，本专利技术提供了如下的技术方案：一种测定骨钙素含量的试剂盒，包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；所述磁微粒试剂是将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制成，所述发光底物是将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制成；分别配制校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；将校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物，独立地置于包装容器内，得到骨钙素的定量测定试剂盒；(一)、所述校准品、质控品的配制，包括以下步骤：用校准品缓冲溶液溶解骨钙素抗原，配制抗试剂的校准品和质控品；其中，所述校准品缓冲溶液是通过在1L的新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g的硫酸新霉素，完全溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成；(二)、所述抗试剂的配制：1)抗试剂缓冲液的制备：将10g～20g的Na2PO3H·12H2O、1～2g的NaPO3H2·12H2O、1g～5g的绵羊血清、3g～10g的新生牛血清、1g～5g的马血清加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用4MHCl调节pH至5～6，制得所述抗试剂缓冲液；2)异硫氰酸荧光素与骨钙素抗体偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的骨钙素包被抗体：首先用缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，然后按照骨钙素抗体：异硫氰酸荧光素溶液＝1:1.1～1:1.5的质量比将二者转移到棕色玻璃瓶里，充分混匀；充分反应后使用pH为8～9的碳酸盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到异硫氰酸荧光素标记的骨钙素包被抗体；3)碱性磷酸酶与骨钙素抗体偶联，获得碱性磷酸酶标记的骨钙素抗体：首先用缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，骨钙素抗体和碱性磷酸酶分别将反应基团分别活化后按照摩尔比为碱性磷酸酶：骨钙素＝1:1～1:3的反应比在催化剂的催化下充分混匀进行偶联反应，充分反应后，使用pH为8～9的tris缓冲液平衡，凝胶柱进行不同分子大小片度的分离纯化，得到碱性磷酸酶标记的骨钙素标记抗体；将步骤2)中获得的异硫氰酸荧光素标记的骨钙素包被抗体和步骤3)中获得的碱性磷酸酶标记的骨钙素标记抗体加入含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌后获得所述抗试剂；优选的，所述步骤3)中的表面活性剂为Tween20、TritonX-100、Bronidox中的一种或多种，表面活性剂的添加量为0.01％～0.5％。进一步的，该试剂盒还包括清洗液，所述清洗液的配置方法将将160gNaCl、4gKCl、24.2g三羟甲基氨基甲烷、1mL吐温20溶于900ml双蒸水中，用HCL调整至PH7.4，用双蒸水定容至1000ml。使用时用双蒸水15倍稀释。进一步的，所述磁微粒试剂是按照以下步骤制备的：1)将充分混匀后的羧基磁珠浓缩液放入反应瓶中，将该反应瓶在磁场内放置15～20min，待羧基磁珠全部沉降后吸去上清，向反应瓶中加入相当于反应瓶中羧基磁珠体积2～5倍的磁微粒缓冲液，震荡清洗20～30min；再将反应瓶置于磁场中15～20min后吸去上清；重复清洗羧基磁珠3遍；最后将羧基磁珠溶液定容到10～50mg/mL，混匀待用；2)连接反应按照质量比羧基磁珠溶液：抗异硫氰酸荧光素抗体＝100:1的比例在步骤1)所制得的羧基磁珠溶液中加入抗异硫氰酸荧光素抗体，在2～8℃内保持混匀状态反应18小时；3)反应瓶在磁场中放置15min，待羧基磁珠沉降后用磁微粒缓冲液洗3遍，随后定容至10mg/mL，2～8℃保存，制得所需待用磁微粒试剂。优选的，所述磁微粒缓冲液的配置方法是将12.12～15.26mg的Tris，5.82～8.58mg的氯化钠，50～60g的甲基纤维醚加入到1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解即得。进一步的，所述发光底物是用相当于ALPS体积4～10倍的发光底物缓冲液充分溶解ALPS制备而成的；所述发光底物缓冲液的配置方法是将12.12g～121.14g的Tris、5.82g的氯化钠、0.03g的光泽精加入到1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用盐酸调节pH至9.5即得。采用该试剂盒测定骨钙素含量的方法，包括以下步骤：1)取三支试管分别加100μL校准品、100μL质控品、100μL待测样本；2)每支试管中加入60μL抗试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置于37℃下水浴15min；3)每支试管中加入30μL磁微粒试剂，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，置37℃下水浴5min；4)将试管在磁分离器上沉淀3min，缓慢地倒转试管和磁分离器，倒出上清液；把倒转的试管连同磁分离器一起，放在滤纸上，拍击磁分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；5)每支试管中加入300μL清洗液，用塑料薄膜覆盖试管，轻轻振荡试管30s，混匀后缓慢的倒转试管和磁分离器，倒出上清液，把倒转的试管连同磁分离器一起，放在滤纸上，用力拍击分离器底部以除去粘在管壁上的所有液滴；6)重复步骤5)一次；7)每支试管中加入200μL发光底物，振荡混匀3s，用化学发光仪检测发光强度。本专利技术的磁微粒试剂是磁微粒与羊抗FITC连接物，含BSA的缓冲液。本专利技术的校准品是分别添加了不同量骨钙素抗原的含BSA的缓冲液。本专利技术的技术原理为：异硫氰酸荧光素(FITC)标记的BGP抗体与碱性磷酸酶(AP)标记的BGP本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定骨钙素含量的试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；所述磁微粒试剂是将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制成，所述发光底物是将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制成；分别配制校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；将校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物，独立地置于包装容器内，得到骨钙素的定量测定试剂盒；(一)、所述校准品、质控品的配制，包括以下步骤：用校准品缓冲溶液溶解骨钙素抗原，配制抗试剂的校准品和质控品；其中，所述校准品缓冲溶液是通过在1L的新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g的硫酸新霉素，完全溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成；(二)、所述抗试剂的配制：1)抗试剂缓冲液的制备：将10g～20g的Na2PO3H·12H2O、1～2g的NaPO3H2·12H2O、1g～5g的绵羊血清、3g～10g的新生牛血清、1g～5g的马血清加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用4M HCl调节pH至5～6，制得所述抗试剂缓冲液；2)异硫氰酸荧光素与骨钙素抗体偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的骨钙素包被抗体：首先用缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，然后按照骨钙素抗体：异硫氰酸荧光素溶液＝1:1.1～1:1.5的质量比将二者转移到棕色玻璃瓶里，充分混匀；充分反应后使用pH为8～9的碳酸盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到异硫氰酸荧光素标记的骨钙素包被抗体；3)碱性磷酸酶与骨钙素抗体偶联，获得碱性磷酸酶标记的骨钙素抗体：首先用缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，骨钙素抗体和碱性磷酸酶分别将反应基团分别活化后按照摩尔比为碱性磷酸酶：骨钙素＝1:1～1:3的反应比在催化剂的催化下充分混匀进行偶联反应，充分反应后，使用pH为8～9的tris缓冲液平衡，凝胶柱进行不同分子大小片度的分离纯化，得到碱性磷酸酶标记的骨钙素标记抗体；将步骤2)中获得的异硫氰酸荧光素标记的骨钙素包被抗体和步骤3)中获得的碱性磷酸酶标记的骨钙素标记抗体加入含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌后获得所述抗试剂。...

【技术特征摘要】
1.一种测定骨钙素含量的试剂盒，其特征在于，包括校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；所述磁微粒试剂是将抗异硫氰酸荧光素抗体与羧基磁珠偶联制成，所述发光底物是将ALPS溶解于发光底物缓冲液中制成；分别配制校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物；将校准品、质控品、抗试剂、磁微粒试剂、发光底物，独立地置于包装容器内，得到骨钙素的定量测定试剂盒；(一)、所述校准品、质控品的配制，包括以下步骤：用校准品缓冲溶液溶解骨钙素抗原，配制抗试剂的校准品和质控品；其中，所述校准品缓冲溶液是通过在1L的新生牛血清中加入0.01g～0.05g的四环素和0.1g～0.5g的硫酸新霉素，完全溶解后经过0.22μm滤膜处理制备而成；(二)、所述抗试剂的配制：1)抗试剂缓冲液的制备：将10g～20g的Na2PO3H·12H2O、1～2g的NaPO3H2·12H2O、1g～5g的绵羊血清、3g～10g的新生牛血清、1g～5g的马血清加入1L纯化水中，充分搅拌至完全溶解，用4MHCl调节pH至5～6，制得所述抗试剂缓冲液；2)异硫氰酸荧光素与骨钙素抗体偶联，获得异硫氰酸荧光素标记的骨钙素包被抗体：首先用缓冲液将异硫氰酸荧光素配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的异硫氰酸荧光素溶液，然后按照骨钙素抗体：异硫氰酸荧光素溶液＝1:1.1～1:1.5的质量比将二者转移到棕色玻璃瓶里，充分混匀；充分反应后使用pH为8～9的碳酸盐缓冲液平衡，然后使用凝胶层析分离纯化得到异硫氰酸荧光素标记的骨钙素包被抗体；3)碱性磷酸酶与骨钙素抗体偶联，获得碱性磷酸酶标记的骨钙素抗体：首先用缓冲液将碱性磷酸酶配制成浓度为1.0～5.0mg/mL的碱性磷酸酶溶液，骨钙素抗体和碱性磷酸酶分别将反应基团分别活化后按照摩尔比为碱性磷酸酶：骨钙素＝1:1～1:3的反应比在催化剂的催化下充分混匀进行偶联反应，充分反应后，使用pH为8～9的tris缓冲液平衡，凝胶柱进行不同分子大小片度的分离纯化，得到碱性磷酸酶标记的骨钙素标记抗体；将步骤2)中获得的异硫氰酸荧光素标记的骨钙素包被抗体和步骤3)中获得的碱性磷酸酶标记的骨钙素标记抗体加入含有表面活性剂的磷酸盐缓冲液中，充分搅拌后获得所述抗试剂。2.根据权利要求1所述的测定骨钙素含量的试剂盒，其特征在于，该试剂盒还包括清洗液，所述清洗液的配置方法将将160gNaCl、4gKCl、24.2g三羟甲基氨基甲烷、1mL吐温20溶于900ml双蒸水中，用HCL调整至PH7.4，用双蒸水定容至1000ml。3.根据权利要求1或2任一项所述的测定骨钙素含量的试剂盒，其特征在于，所述步骤3)中的表面活性剂为Tween20、Tri...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨旻，刘振国，薛玲，姚广城，夏振伟，
申请(专利权)人：江苏泽成生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32