本发明专利技术公开了一种内皮细胞受体蛋白酪氨酸激酶A2免疫原多肽，属于抗癌疫苗领域。具体涉及用作抗癌疫苗的内皮细胞受体蛋白酪氨酸激酶A2免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。该氨基酸序列为全新的序列，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用，以及在制备用于CAR‑T细胞免疫治疗的应用。本发明专利技术的有益效果在于为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原，能（1）促进T细胞增殖，（2）促进CD8+免疫应答，（3）能与T细胞表面的MHC有效的特异性结合，（4）促进T细胞与肿瘤细胞的结合，（5）在荷瘤小鼠体内，能提高生存率。作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR‑T等细胞疗法。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术是有关抗癌疫苗领域。具体来说，本专利技术涉及用作抗癌疫苗的内皮细胞受体蛋白酪氨酸激酶A2免疫原的优化多肽，增强T细胞免疫应答。
技术介绍
肿瘤细胞免疫治疗是一种新兴的、具有显著疗效的肿瘤治疗模式，是一种自身免疫抗癌的新型治疗方法。它是运用生物技术和生物制剂对从病人体内采集的免疫细胞进行体外培养和扩增后回输到病人体内的方法，来激发，增强机体自身免疫功能，从而达到治疗肿瘤的目的。肿瘤细胞免疫疗法是继手术、放疗和化疗之后的第四大肿瘤治疗技术。酪氨酸蛋白激酶受体(receptortyrosinekinases，RTKs)参与细胞增生和分化、胚胎发育和细胞内信号转导等过程，具有重要的生理功能.生促红素人肝细胞(erythropoietin-producinghumanhepatocelluar，Eph)A2是Eph受体酪氨酸蛋白激酶家族RTKs中的一员，广泛表达在人类多种组织或细胞系中，对调节细胞生长、迁移及血管形成有潜在的作用.EphA2过表达可导致细胞的恶性转化，增强肿瘤细胞的侵袭性和转移性。EphA2有望成为恶性肿瘤治疗的新的靶点和预后指标。近年研究表明，EphA2在许多肿瘤组织中呈过度表达，尤其高表达于高侵袭性的肿瘤细胞，包括乳腺癌、结肠癌、前列腺癌、食管癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、宫颈癌、卵巢癌和恶性黑色素瘤等。EphA2是高侵袭性的肿瘤细胞的标记物，可以作为肿瘤疫苗的特异性免疫原。然而，EphA2由976个氨基酸残基组成蛋白，为膜结合I型糖蛋白，分子量较大，较难得到纯度高的EphA2。这样，不仅会给后期的特异性T细胞免疫带来困难，而且会导致患者的自身免疫。因此，本专利技术提供了一种特异性强，纯度较高的小分子多肽作为免疫原。
技术实现思路
专利技术目的本专利技术提供一种内皮细胞受体蛋白酪氨酸激酶A2免疫原多肽，可用于肿瘤细胞免疫的免疫原，增强T细胞免疫应答，具有分子量小、特异性免疫原性强的特点。技术方案本专利技术的技术方案在于提供一种内皮细胞受体蛋白酪氨酸激酶A2免疫原多肽，序列为HMGMWEVMTYGERPYWELSFMHMKAINDGFRLPTRGDCP(SEQIDNO：1)。该氨基酸序列为全新的序列，在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。尤其在制备用于肿瘤免疫细胞，增强T细胞免疫应答药物中的应用，以及在制备用于CAR-T细胞免疫治疗的应用。有益效果本专利技术的内皮细胞受体蛋白酪氨酸激酶A2免疫原多肽，为全新的序列，可用于肿瘤免疫细胞技术中的免疫原。有益效果在于(1)促进T细胞增殖，(2)促进CD8+免疫应答，(3)能与T细胞表面的MHC有效的特异性结合，(4)促进T细胞与肿瘤细胞的结合，(5)在荷瘤小鼠体内，能提高生存率。作为细胞疗法的靶标分子，应用于CAR-T等细胞疗法。具体实施方式多肽由上海生工吉尔合成。实施例1用肿瘤模型检测内皮细胞受体蛋白酪氨酸激酶A2免疫原多肽的体内活力。6-8周龄C57BL/6小鼠，小鼠随机分成4组，雌雄各半，每组10只。(1)空白组；(2)多肽低剂量组；(3)多肽中剂量组；(4)多肽高剂量组。建立黑色素瘤荷瘤动物模型，在接种肿瘤细胞后的第3、5、7天，分别进行免疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量：5、10、20mg/Kg，在肿瘤周围多点注射。21天后，观察小鼠存活数量，计算存活率。结果显示，多肽可有效地保护小鼠，提高荷瘤小鼠的生存率，高剂量多肽组的生存率达到71.1％。实施例2应用竞争性受体-配体亲和法测试多肽与MHC的结合能力：将多肽与HLA各型的结合能力由竞争性受体-配体亲和法判断。将固定浓度为50μmol/L的标记125I的多肽以及不同浓度(1-50μmol/L)的多肽加入反应体系(磷酸盐缓冲液和MHC，所述的MHC试剂盒购自上海泛柯生物科技有限公司，试剂盒内有HLA-A1、A2、A3、A11和A24)，在反应体系中形成两种复合物，即待测多肽MHC复合物和125I标记多肽复合物。待测多肽与125I标记多肽竞争与MHC的结合。用超过滤(产品型号Microcon30，Amicon公司)分离游离多肽和多肽MHC复合物，然后测定多肽MHC复合物的125I放射量，将此放射量与没有竞争性抑制的多肽MHC复合物(没有加待测多肽的样本)的放射量比较，求待测多肽在抑制50％标记多肽与MHC结合时的浓度，即IC50。由此得到，多肽对HLA-A1、A2、A3、A11和A24的IC50值分别为3.21、4.25、1.61、3.45和7.51μmol/L，均符合阳性多肽的标准(≤10μM)。因此，多肽为具有有效结合能力的免疫原多肽。实施例3T淋巴细胞的增殖作用：无菌取小鼠脾脏，1640培养基清洗3次，5ml注射器芯研磨，200目筛网过滤，制成单细胞悬液，离心(1000r/min，5min)，弃上清，Tris-NH4CL破解红细胞，冰水浴静置3-5min，离心(1000r/min，5min)，弃上清，用无菌冷PBS洗涤细胞两次。最后加入10％小牛血清的RPMI1640培养液(5ml)悬浮细胞，细胞计数，调整细胞浓度为5×106个/ml，于96孔培养板中培养。实验设空白对照组、模型组(刀豆蛋白A，sigma公司购买)、多肽各剂量(5、10、20mg/ml)组。各组分别加入脾脏淋巴细胞悬液100μl/孔后，空白对照组加入1640培养液100μl，模型组加入ConA(终浓度为5μg/ml)，多肽各剂量组在加入不同浓度的多肽基础上加ConA(终浓度为5μg/ml)。37℃细胞培养箱静止培养48h，培养结束后每孔加入20μlMTT，继续培养4h，最后弃掉每孔所有溶液，每孔加入100μlDMSO，震荡，用酶标仪检测570nm处OD值，每孔设5个平行。表1多肽对T淋巴细胞的增殖作用*P<0.05，**P<0.01与模型组相比。实验结果见表1，与模型组比较，多肽能促进小鼠脾脏淋巴细胞的增殖，在剂量为5～20mg/ml的范围呈现很好的剂量依赖关系。实施例4内皮细胞受体蛋白酪氨酸激酶A2免疫原多肽的免疫原性测定：采用流式细胞技术测定免疫原多肽对CD8+T细胞的影响。6-8w龄C57BL/6小鼠，小鼠随机分成4组，每组10只。(1)空白组；(2)免疫原多肽低剂量组；(3)免疫原多肽中剂量组；(4)多肽高剂量组。在试验的第0、7、14天，分别进行免疫。方案为：空白组加入相同体积的溶剂，实验组多肽设3个剂量：5、10、20mg/Kg，在小鼠背部淋巴结附近多点注射。30天后，眼球取血0.8ml，肝素抗凝，将血离心后取血细胞层，用红细胞裂解液破解红细胞，洗去裂解的红细胞，再用荧光标记的单克隆抗CD8+-FITC(购自北京华泰昕生物医疗技术有限公司)孵育、固定后，进行流式细胞技术测定，评价免疫原多肽对CD8+T细胞的影响。实验结果显示，与空白组比较，多肽能促进小鼠CD8+T淋巴细胞(P<0.01)，低中高剂量组的结合率分别为62.33、76.51和86.02％。在剂量为5～20mg/Kg的范围呈现很好的剂量依赖关系。实施例5内皮细胞受体蛋白酪氨酸激酶A2免疫原多肽的T细胞结合试验：采用玫瑰花环试验评价T细胞与人黑色素瘤细胞A375的结合能力。无菌取豚鼠胸腺，1本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种内皮细胞受体蛋白酪氨酸激酶A2免疫原多肽，其特征在于：所述的多肽序列为SEQ ID NO：1。
【技术特征摘要】
1.一种内皮细胞受体蛋白酪氨酸激酶A2免疫原多肽，其特征在于：所述的多肽序列为SEQIDNO：1。2.根据权利要求1所述的多肽，其特征在于：在制备用于治疗肿瘤药物中的应用。3....
【专利技术属性】
技术研发人员：罗瑞雪，
申请(专利权)人：苏州普罗达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32
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