一种用于检测精子生成障碍传代效应的标志性微小核糖核酸标志物及其应用制造技术

一种用于检测精子生成障碍传代效应的标志性微小核糖核酸标志物及其应用。本发明专利技术属于生物技术及生殖医学领域，公开了一种用于检测精子生成障碍传代效应中的微小核糖核酸(microRNA，miRNA)标志物及其应用。该标志物选自rho‑miR‑1‑3p、rho‑miR‑124‑3p、rho‑miR‑190a‑5p中的多种。该标志物对监测精子生成障碍传代效应具有特异性和敏感性，为精子生成障碍传代效应的诊断监测提供一种可靠的检测依据和快速检测方法，具有重要的应用价值。

【技术实现步骤摘要】
专利
本专利技术属于生物技术及生殖医学领域，涉及一种用于检测精子生成障碍传代效应中的微小核糖核酸(microRNA，miRNA)标志物及其应用。
技术介绍
目前，全球约有10-15％的育龄夫妇患有生育障碍。我国由于人口基数大，新婚夫妇中不孕不育的患者人数远超过百万，因男性因素导致的不育高于50％。生精障碍已成为男性不育最常见的疾病。精子生成是一个复杂的过程，包括环境因素在内的多种因素调控和影响精子的发育与成熟，可导致生精障碍。半个世纪以来，男性的精子数量有了相当程度的下降。这提示生精障碍发生率的提高与环境的改变，尤其是日益加重的环境污染有着密切的联系。动物实验表明，邻苯二甲酸二丁酯(DBP)对雄性生殖系统的生长发育及功能具有明显的干扰作用，包括精子生成障碍、睾酮合成下降、睾丸发育不全、生殖道发育异常以及性发育延迟等。DBP的暴露不仅影响亲代(F0代)大鼠，还可影响第一代(F1代)乃至第二代(F2代)的生殖和发育。传代效应是指可遗传物质从双亲传递给子代并且至少要维持3代。国际化学品安全规划署认为DBP不具有遗传毒性。因此损伤机制有可能来自于遗传外机制。表观遗传修饰对环境变化非常敏感，如果在表观遗传形成期暴露于特殊环境，有可能会导致表观遗传模式的异常，从而导致胚胎的死亡和发育不良。胚胎发育早期经历了全基因组范围的表观遗传重编程过程，当表观遗传重编程受到环境化学物的干扰时，表观遗传修饰可发生改变，从而影响其表型，甚至增加成年疾病的易感性。若要观察到传代效应的出现，需要观察的时间较长，如何在早期就能判断由于环境改变导致的精子生成障碍是具有传代效应，还未有研究。因此，选择高特异性及敏感性的标志物，并能够确立快速、准确的实验方法，对于检测精子生成障碍的传代效应的发生具有重要的价值。miRNA是一类长度约为22个核苷酸的小非编码单链RNA分子，它存在于大多数真核细胞内，多位于基因组非编码区域，在进化上高度保守，可在转录后水平对基因表达进行调节。对其功能研究也日益增多，发现它与动物的许多正常生理活动相关，这些生理活动包括细胞凋亡、组织分化、个体的发育、能量代谢等关，同时也与许多疾病例如代谢性疾病、生殖系统甚至是肿瘤的发生及发展都存在着紧密的关联。近些年来，对miRNA在精子发生中的调控机制研究也有了一些重要的结果，且这种调控作用贯穿于精子生成的整个过程中。miR-19a、miR-19b、miR-221和miR-222能够维持精原细胞处于分化状态，在原始生殖细胞增殖中起调控作用的；miR-203和miR-34b-5p主要在精子发生的晚期阶段表达，对精子生成的后期阶段发挥调控作用；miR-24能调控精子在减数分裂时期的分裂的过程；miR-17-5p能够使生精细胞的凋亡减少，利于精子的正常生成。miRNA主要的调控方式是由成熟的miRNAs组装进RNA诱导的沉默复合体(RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)，通过miRNA的种子序列与其碱基互补配对结合，将沉默复合体定位在靶mRNA上，并根据互补程度的不同导致沉默复合体降解靶mRNA或者阻遏靶mRNA的翻译，进而产生抑制作用。miRNA在宫内EDCs暴露引起疾病传代效应中也起重要调控作用。近年来的研究发现，miR-23b和miR-21可以作为一种表观遗传信息的载体，将乙烯菌核利导致的原生殖细胞异常及生殖细胞分化的异常传递给后代，从而影响后代成年期疾病的发病风险。miRNA还能够通过生殖系的传递，从而影响HPA轴的表型以及下丘脑的重塑。这些所识别出的miRNA，能针对特定的mRNA进行作用，为父系RNA的传递以及对表观遗传的作用研究提供思路。在受到DBP的暴露刺激之后，所造成的雄性生精障碍传代效应过程中，一部分miRNA的表达改变可持续多代。因此，筛选特异性miRNA作为检测标志物，建立基于该标志物的检测方法意义重大。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于检测精子生成障碍传代效应的标志性microRNA标志物本专利技术的另一个目的是提供上述microRNA标志物的引物。本专利技术还有一个目的是提供含有上述microRNA标志物或其引物的应用。本专利技术再有一个目的是提供含有上述microRNA标志物或其引物的精子生成障碍传代效应的诊断或监测试剂盒。本专利技术的目的是通过下列技术措施实现的：一种用于检测生精障碍传代效应的microRNA标志物，选自rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p、rho-miR-190a-5p中的至少两种。作为一种优选技术方案，所述的microRNA标志物由rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p和rho-miR-190a-5p组成。上述的microRNA标志物，其中rho-miR-1-3p的序列为SEQIDNo.1，rho-miR-124-3p的序列为SEQIDNo.2，rho-miR-190a-5p的序列为SEQIDNo.3。上述的microRNA标志物的引物，其中rho-miR-1-3p的上游引物为SEQIDNo.4，下游引物为SEQIDNo.5；rho-miR-124-3p的上游引物为SEQIDNo.6，下游引物为SEQIDNo.7；rho-miR-190a-5p的上游引物为SEQIDNo.8，下游引物为SEQIDNo.9。所述的microRNA标志物或其引物在制备精子生成障碍传代效应中的诊断或监测试剂或试剂盒中的应用。所述试剂或试剂盒是指能够测定这些microRNA标志物在睾丸中表达量的试剂。一种精子生成障碍传代效应的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述microRNA标志物(rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p、rho-miR-190a-5p)的引物。所述的诊断或监测试剂盒，该试剂盒含有上述引物(SEQIDNo.4和SEQIDNo.5，SEQIDNo.6和SEQIDNo.7，以及SEQIDNo.8和SEQIDNo.9)中的至少两对，优选为含有上述引物的三对。进一步优选的，该试剂盒中还可以含有内参U6的正反向引物一对(SEQIDNo.10和SEQIDNo.11)。试剂盒中除引物外的其他试剂可采用现有技术中相应检测技术的常用试剂。本专利技术采用精子生成障碍传代效应的评价的标志物的优越性在于：(1)miRNA是一种新型生物标志物，区别于传统生物标志物，不仅稳定、易于检测，且定量精确，将大大提高诊断及监测的敏感性和特异性，为其他疾病表型传代效应生物标志物的研制提供借鉴。(2)本专利技术提供的miRNA标志物可用于精子生成障碍传代效应的评估和动态监测，可避免长时间的实验，可反复检测，且易于动态监测，对于各种物质的生殖毒性传代效应的评价提供新的思路。(3)本专利技术采用严密、多阶段的验证和评价体系，初期通过预实验筛选数百种miRNAs，应用Real-timePCR等方法再进行二次验证，采用分层评分系统对结果进行标化，保证了该miRNA生物标志物和诊断监测试剂盒的可靠性。附图说明图1在F1至F3代，精子计数(CASA分析结果)。图2rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p和rho-miR-190a-5p三个miRNAs在精子生成传代效应组与对照组中的表达水平。图3以rho-miR-1-3p、本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测生精障碍传代效应的microRNA标志物，其特征在于：该microRNA标志物选自rho‑miR‑1‑3p、rho‑miR‑124‑3p、rho‑miR‑190a‑5p中的至少两种。

【技术特征摘要】
1.一种用于检测生精障碍传代效应的microRNA标志物，其特征在于：该microRNA标志物选自rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p、rho-miR-190a-5p中的至少两种。2.根据权利要求1所述的microRNA标志物，其特征在于：该microRNA标志物由rho-miR-1-3p、rho-miR-124-3p和rho-miR-190a-5p组成。3.根据权利要求1或2所述的microRNA标志物，其特征在于：rho-miR-1-3p的序列为SEQIDNo.1，rho-miR-124-3p的序列为SEQIDNo.2，rho-miR-190a-5p的序列为SEQIDNo.3。4.权利要求1～3中任一所述的microRNA标志物的引物，其特征在于：rho-miR-1-3p的上游引物为SEQIDNo.4，下游引物为SEQIDNo.5；rho-...

【专利技术属性】
技术研发人员：吴炜，袁蓓蕾，汤秋勤，芮璨，居蓉，陈丽平，夏彦恺，王心如，
申请(专利权)人：南京医科大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32