本发明专利技术公开了一种基于气相色谱质谱的烟草茎部代谢组学分析方法，包括样品前处理、色谱质谱分离、代谢物结构鉴定、代谢物的定量分析、数据分析步骤。本发明专利技术采用极性溶剂和非极性溶剂分别萃取烟草茎部极性代谢物和非极性代谢物，采用保留指数和质谱谱图库定性鉴定气相色谱质谱所采集的所有代谢物，采用非靶标定量分析方法定量分析所采集的所有代谢物。该方法的建立为开展烟草茎部代谢组学相关研究提供了重要的参考。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于分析化学
，具体涉及一种基于气相色谱质谱的烟草茎部代谢组学分析方法。
技术介绍
烟草是一种重要的经济作物和模式植物，其化学组分十分复杂，次生代谢产物种类繁多，而这些次生代谢产物可能与烟草对环境、疾病等外界刺激有重要的生理关系。代谢组学是是系统生物学的重要组成部分，是对生物系统因病理生理刺激以及基因、环境等改变所致动态多参数代谢应答的定性定量研究。代谢组学是近年来迅速发展的一个研究领域，从1997年提出代谢组学的概念以来，在植物、动物和微生物研究领域取得了卓有成效的成绩，尤其在植物代谢组学研究方面许多国内外知名大学和研究单位都开展了相关研究工作。代谢组学研究所采用的分析方法主要有核磁共振光谱法、液相色谱质谱法、气相色谱质谱法等。到目前为止，气相色谱质谱由于其操作成本低、定性定量能力强以及对代谢物的覆盖面广等特点，已经成为植物代谢组学研究最重要的分析方法之一。烟草是植物生物学研究非常重要的一种模式植物，也是非常重要的一种经济植物。目前，人们已在烟草品质、抗病、抗虫等方面开展了大量的研究，这些研究主要是从基因、环境等方面展开，而从代谢组学的角度开展研究的相关报道却较少。这主要是因为代谢组学目前仍是一种不断完善和发展的研究方法。由于烟叶是烟草的主要经济器官，人们对于烟草的研究主要集中在烟叶上，不过烟草的很多重要代谢物（例如尼古丁）都是通过根合成，然后经茎转至叶。同时烟草的很多疾病（例如黑胫病）与茎直接相关。因此建立烟草茎的代谢组学研究方法具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于气相色谱质谱的烟草茎部代谢组学分析方法。本专利技术的目的是这样实现的，包括样品前处理、色谱质谱分离、代谢物结构鉴定、代谢物的定量分析、数据分析步骤，具体包括：A、样品前处理：将新鲜的烟草茎部样品剪成小块置入研钵，加液氮冷冻，研磨，冷冻干燥后得到冻干烟草茎部样本，于4℃进行保存；B、色谱质谱分离：1）极性代谢物的提取及衍生化：准确称取20.0mg的冻干烟草茎部样本于1.5mL离心管，加入370μL甲醇、480μL去离子水、450μL甲基叔丁基醚和200μL内标溶液，超声，离心，取下清液600μL，放入冻干机离心浓缩2小时以去掉溶剂，取出样品加入100μL甲氧胺溶液，37℃恒温肟化90min，加入80μLMSTFA，37℃恒温硅烷化30min，衍生完的样品转至气相色谱质谱仪分析，进样量1μL；2）非极性代谢物的提取：准确称取100.0mg冻干烟草茎部样本，加入4.9mL二氯甲烷和100μL内标溶液，超声30min，离心，取上清液2mL氮气吹干，加入200μL二氯甲烷复溶，复溶后提取液转至气相色谱质谱仪分析，进样量1μL；C、代谢物结构鉴定：采用质谱去卷积和谱图库检索、保留指数、标准化合物验证相结合的方法进行化合物定性；D、代谢物的定量分析：将代谢物的峰面积与内标物的峰面积相除，获得相对定量信息，具体计算公式如下：其中，Cx和C1分别代表代谢物x和内标的含量，μg/g；Ax和A1分别代表代谢物x和内容的色谱峰面积；E、数据分析：将每个分析样本中极性代谢物和非极性代谢物的定量分析结果进行统计，采用主成分分析和聚类分析作为多变量分析方法，进行样本之间的相对关系研究，采用T检验作为单变量统计分析方法，寻找关键代谢物。本专利技术采用极性溶剂和非极性溶剂分别萃取烟草茎部极性代谢物和非极性代谢物，采用保留指数和质谱谱图库定性鉴定气相色谱质谱所采集的所有代谢物，采用非靶标定量分析方法定量分析所采集的所有代谢物。该方法的建立为开展烟草茎部代谢组学相关研究提供了重要的参考。附图说明图1为红大和TN90茎部的主成分分析得分图（左）和载荷图（右）；图2为红大和TN90茎部代谢物无监督聚类分析图；图3为红大和TN90茎部代谢物的T检验结果火山图；图4为烟草茎部极性代谢物的气相色谱质谱分析总离子流图；图5为烟草茎部非极性代谢物的气相色谱质谱分析总离子流图。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步的说明，但不以任何方式对本专利技术加以限制，基于本专利技术教导所作的任何变换或替换，均属于本专利技术的保护范围。本专利技术所述的基于气相色谱质谱的烟草茎部代谢组学分析方法，包括样品前处理、色谱质谱分离、代谢物结构鉴定、代谢物的定量分析、数据分析步骤，具体包括：A、样品前处理：将新鲜的烟草根样品剪成小块置入研钵，加液氮冷冻，研磨，冷冻干燥后得到冻干烟草茎部样本，于4℃进行保存；B、色谱质谱分离：1）极性代谢物的提取及衍生化：准确称取20.0mg的冻干烟草茎部样本于1.5mL离心管，加入370μL甲醇、480μL去离子水、450μL甲基叔丁基醚和200μL内标溶液，超声，离心，取下清液600μL，放入冻干机离心浓缩2小时以去掉溶剂，取出样品加入100μL甲氧胺溶液，37℃恒温肟化90min，加入80μLMSTFA，37℃恒温硅烷化30min，衍生完的样品转至气相色谱质谱仪分析，进样量1μL；2）非极性代谢物的提取：准确称取100.0mg冻干烟草茎部样本，加入4.9mL二氯甲烷和100μL内标溶液，超声30min，离心，取上清液2mL氮气吹干，加入200μL二氯甲烷复溶，复溶后提取液转至气相色谱质谱仪分析，进样量1μL；C、代谢物结构鉴定：采用质谱去卷积和谱图库检索、保留指数、标准化合物验证相结合的方法进行化合物定性；D、代谢物的定量分析：将代谢物的峰面积与内标物的峰面积相除，获得相对定量信息，具体计算公式如下：其中，Cx和C1分别代表代谢物x和内标的含量，μg/g；Ax和A1分别代表代谢物x和内容的色谱峰面积；E、数据分析：将每个分析样本中极性代谢物和非极性代谢物的定量分析结果进行统计，采用主成分分析和聚类分析作为多变量分析方法，进行样本之间的相对关系研究，采用T检验作为单变量统计分析方法，寻找关键代谢物。A步骤中研磨后的样品粒径为小于40目。A步骤中冷冻干燥的真空度为0.18mbar，温度为-6℃。B步骤1）中所述的内标溶液为100μg/mL的对羟基香豆酸水溶液。B步骤1）中超声的频率为25~45kHz，时间为20~30min。B步骤1）中离心的离心力≥5000g。B步骤1）中冻干机离心浓缩的真空度为0.18mbar，温度为-6℃。B步骤1）中所述的甲氧胺溶液的浓度为20mg/ml。B步骤2）中所述的内标溶液为100μg/mL的桃醛的二氯甲烷溶液；所述的离心的离心力≥10000g。B步骤中色谱分析条件为：色谱柱为DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)，程序升温条件为60℃保持1min，5℃/min升至280℃，保持15min；进样口温度为250℃；进样体积为1μL；载气为氦气；柱流量为1.1mL/min；分流比为20:1；质谱分析条件为：传输线温度为230℃；离子源温度210℃；非极性代谢物的溶剂延迟时间为2min，极性衍生化样品的溶剂延迟时间为7min；质量扫描范围为m/z35-400；质谱扫描速度为5Hz。下面以一月苗龄的林烟草根为例进行分析，具体为：1、样品前处理1.1实验试剂及装置甲醇（色谱级）购买于德国Merck公司；超纯水由Millipore纯化系统制备。对羟基香豆酸和桃醛（内标化合物）购买于百灵威公司；0#轻本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于气相色谱质谱的烟草茎部代谢组学分析方法，其特征在于包括样品前处理、色谱质谱分离、代谢物结构鉴定、代谢物的定量分析、数据分析步骤，具体包括：A、样品前处理：将新鲜的烟草茎部样品剪成小块置入研钵，加液氮冷冻，研磨，冷冻干燥后得到冻干烟草茎部样本，于4℃进行保存；B、色谱质谱分离：1）极性代谢物的提取及衍生化：准确称取20.0 mg的冻干烟草茎部样本于1.5 mL离心管，加入370 μL甲醇、480 μL去离子水、450 μL甲基叔丁基醚和200 μL内标溶液，超声，离心，取下清液600 μL，放入冻干机离心浓缩2小时以去掉溶剂，取出样品加入100 μL甲氧胺溶液，37 ℃恒温肟化90 min，加入80 μL MSTFA，37 ℃恒温硅烷化30 min，衍生完的样品转至气相色谱质谱仪分析，进样量 1 μL；2）非极性代谢物的提取：准确称取100.0 mg冻干烟草茎部样本，加入4.9 mL二氯甲烷和100 μL内标溶液，超声30 min，离心，取上清液2 mL氮气吹干，加入200 μL二氯甲烷复溶，复溶后提取液转至气相色谱质谱仪分析，进样量 1 μL；C、代谢物结构鉴定：采用质谱去卷积和谱图库检索、保留指数、标准化合物验证相结合的方法进行化合物定性；D、代谢物的定量分析：将代谢物的峰面积与内标物的峰面积相除，获得相对定量信息，具体计算公式如下：其中，Cx和C1分别代表代谢物x和内标的含量，μg/g；Ax和A1分别代表代谢物x和内容的色谱峰面积；E、数据分析：将每个分析样本中极性代谢物和非极性代谢物的定量分析结果进行统计，采用主成分分析和聚类分析作为多变量分析方法，进行样本之间的相对关系研究，采用T检验作为单变量统计分析方法，寻找关键代谢物。...
【技术特征摘要】
1.一种基于气相色谱质谱的烟草茎部代谢组学分析方法，其特征在于包括样品前处理、色谱质谱分离、代谢物结构鉴定、代谢物的定量分析、数据分析步骤，具体包括：A、样品前处理：将新鲜的烟草茎部样品剪成小块置入研钵，加液氮冷冻，研磨，冷冻干燥后得到冻干烟草茎部样本，于4℃进行保存；B、色谱质谱分离：1）极性代谢物的提取及衍生化：准确称取20.0mg的冻干烟草茎部样本于1.5mL离心管，加入370μL甲醇、480μL去离子水、450μL甲基叔丁基醚和200μL内标溶液，超声，离心，取下清液600μL，放入冻干机离心浓缩2小时以去掉溶剂，取出样品加入100μL甲氧胺溶液，37℃恒温肟化90min，加入80μLMSTFA，37℃恒温硅烷化30min，衍生完的样品转至气相色谱质谱仪分析，进样量1μL；2）非极性代谢物的提取：准确称取100.0mg冻干烟草茎部样本，加入4.9mL二氯甲烷和100μL内标溶液，超声30min，离心，取上清液2mL氮气吹干，加入200μL二氯甲烷复溶，复溶后提取液转至气相色谱质谱仪分析，进样量1μL；C、代谢物结构鉴定：采用质谱去卷积和谱图库检索、保留指数、标准化合物验证相结合的方法进行化合物定性；D、代谢物的定量分析：将代谢物的峰面积与内标物的峰面积相除，获得相对定量信息，具体计算公式如下：其中，Cx和C1分别代表代谢物x和内标的含量，μg/g；Ax和A1分别代表代谢物x和内容的色谱峰面积；E、数据分析：将每个分析样本中极性代谢物和非极性代谢物的定量分析结果进行统计，采用主成分分析和聚类分析作为多变量分析方法，进行样本之间的相对关系研究，采用T检验作为单变量统计分析方法，寻找关键代谢物。2.根据权利要求1所述的基于气相色谱质谱的烟草茎部代谢组学分析方法，其特征在于A步骤中研磨后的样品粒径为小于40目...
【专利技术属性】
技术研发人员：李勇，逄涛，师君丽，卢秀萍，
申请(专利权)人：云南省烟草农业科学研究院，
类型：发明
国别省市：云南;53
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