本发明专利技术涉及一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白及其应用，该蛋白核苷酸序列如SEQ ID No.1，蛋白序列如SEQ ID No.2，其用于猪流行性腹泻病毒抗体检测，具体采用间接ELISA的方法。本发明专利技术的猪流行性腹泻病毒N蛋白为可溶性形式，有利于蛋白的纯化，而且能够更好地保证蛋白的生物学活性；本发明专利技术提供的检测方法，检测结果稳定，具有良好的重复性，有进一步开发应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物
，具体涉及一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白及其应用。
技术介绍
猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus,PEDV）可引起猪流行性腹泻（PED），PED是一种高度接触传染性的病毒性肠道传染病，危害严重。PEDV属于冠状病毒科（Coronaviridae）冠状病毒属（Coronavirus），略呈球形，有囊膜，囊膜上有花瓣状纤突。其基因组为单股正链RNA，全长约28kb，包括7个ORFs，从5′到3′端依次编码：复制酶（1a、1b）、纤突蛋白（S）、ORF3蛋白、小膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）。S、E、M和N蛋白为结构蛋白，其中N蛋白与基因组RNA相互缠绕形成病毒核衣壳，在病毒RNA合成过程中发挥重要作用，促进病毒组装和RNA复制体的合成。N蛋白保守性强，可以作为PED早期诊断的重要靶蛋白。可溶性表达N蛋白的表达明显简化了蛋白的制备与纯化步骤，能够很好地保持蛋白的抗原活性，可以为快速诊断方法的建立、特异性多克隆或单克隆抗体的制备提供必要的实验材料，是本领域研究的热点，具有广泛的应用前景。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是，提供一种猪流行性腹泻病毒N蛋白，其具有可溶性，同时提供该蛋白在猪流行性腹泻病毒抗体检测中的应用，提高猪流行性腹泻的检测效率。本专利技术解决其技术问题采用的技术方案是：一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白，其核苷酸序列如SEQIDNo.1，蛋白序列如SEQIDNo.2。进一步的，该可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白由步骤包括：应用TRIzol方法提取PEDV基因组RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板用引物U2–L2进行PCR，其中U2如SEQIDNo.3：5’-AATGACCGTGGTGGAATG-3’，L2序列如SEQIDNo.4：5’-TTAATTTCCTGTGTCGAAG-3’。本专利技术同时提供该可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白的应用，其用于猪流行性腹泻病毒抗体检测。进一步的，该应用采用间接ELISA方法进行抗体检测，具体过程为：（1）抗原包被板的制备：用pH9.6的碳酸盐缓冲液将纯化的重组N蛋白稀释成1.0μg/mL，加入96孔酶标反应板，每孔100μL，置37℃孵育1h后，置4℃过夜；弃去孔中液体，用含质量分数为0.05%Tween-20的PBS洗涤（PBST），洗涤优选采用每孔280μl，洗涤3次，每次3min，洗涤后甩去孔中液体，最后一次甩掉后，在吸水材料上用力扣板；（2）封闭：加入含质量分数为5%马血清的PBST，100μL/孔，置37℃下孵育2h，弃去孔中液体，在吸水材料上用力扣板；（3）加被检血清及对照血清：取被检血清样品20μL加入到血清稀释板的各孔内，再将稀释液0.78mL依次加入各孔内，作1:40倍稀释；混匀后分别取100μL依次加入抗原包被反应孔中，每份血清加两个孔。每块反应板设阴性血清和阳性血清对照（不稀释）各两孔，每孔100μL；盖好酶标板置室温反应1h，洗涤同步骤（1）的洗涤方式；（4）加酶标记抗体：加入PBST稀释的酶标记抗体，100μL/孔，室温下作用1h，洗涤同（1）；优选为1:500稀释，抗体选用HRP-羊抗猪IgG；（5）加底物缓冲液：每孔加新配制的TMB底物溶液100μL，室温避光显色15min；（6）终止反应见阳性对照血清孔呈蓝色，阴性对照血清孔无色或基本无色，加入2mol/L硫酸溶液50μL/孔，终止反应；（7）酶标仪测定OD值：在波长450nm读数，15min内完成；（8）结果判定：当被检血清的OD值≥0.3时，判定为阳性；当OD值≤0.3时，判定为阴性。本专利技术的猪流行性腹泻病毒N蛋白为可溶性形式，氨基酸序列较短，能够利用有限的长度表达出该可溶性N蛋白，具有结构的高效性。可溶性表达不仅有利于蛋白的纯化，而且能够更好地保证蛋白的生物学活性。该蛋白能够与猪抗PEDV特异性抗体特异性结合，说明重组tN蛋白具有反应原性。纯化的tN蛋白能够诱导小鼠产生针对PEDV的特异性抗体，该抗体能够分别与包被于ELISA板上的PEDV及Vero细胞内的PEDV发生特异性结合，证明重组tN蛋白具有良好的抗原活性，可以作为诊断抗原、免疫原及制备单克隆抗体的基础材料。该可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白应用于猪流行性腹泻病毒的检测，可以大大提高检测的高效性和灵敏度；本专利技术筛选出的检测条件，为最佳条件，相互配合能够大大提高检测的P/N值。以重组蛋白代替病毒作为包被抗原不仅节约成本，而且对操作人员安全，无散毒潜在威胁。相同和不同批次蛋白均具有良好的稳定性，检测结果稳定，说明建立的ELISA方法具有良好的重复性，有进一步开发应用价值。附图说明图1为ELISA方法的特异性检测结果。具体实施方式为使本专利技术的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面将结合本专利技术实施例中的附图和具体实施方式，对本专利技术的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。实施例1可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白的表达（1）tN蛋白基因的扩增应用TRIzol方法提取PEDV基因组RNA，反转录合成cDNA。以cDNA为模板用引物U2–L2，其中U2：5’-AATGACCGTGGTGGAATG-3’，L2：5’-TTAATTTCCTGTGTCGAAG-3’，进行PCR，扩增体系为50µL。扩增条件为：94℃3min；94℃45s；58.6℃45s；72℃45s，32个循环；72℃10min，扩增片段大小为705bp。PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳检测后，用离心柱型DNA凝胶纯化回收试剂盒回收目的基因。（2）重组质粒pET32a-PEDV-tN的构建与鉴定将胶回收的PCR产物及原核表达载体pET32a(+)分别用限制性核酸内切酶BamHI和XhoI消化，纯化回收酶切产物，用T4DNA连接酶连接PCR产物与pET32a(+)；8~10h后，将连接产物（pET32a-PEDV-tN）转化DH5α感受态细胞，于37℃震摇1h后，将其涂布于Amp+/LB平板上，37℃培养18~24h；挑取菌落做PCR鉴定，提取质粒用BamHI和XhoI酶切鉴定；将鉴定为阳性的菌落进行序列测定。（3）PEDVtN蛋白的表达取重组质粒pET32a-PEDV-tN转化E.coliBL21感受态细胞，挑取阳性菌落接种到Amp+的2×YT培养基中，37℃230r/min振摇培养至对数生长期(OD600nm=0.6~0.8)时，加入终浓度为0.5mmol/L的IPTG，于28℃温度下诱导表达5h。同时设立BL21、转化pET32a(+)空质粒的BL21对照。收集诱导后菌液1mL，5000r/min离心5min，取菌体沉淀，用12%的聚丙烯酰胺凝胶进行SDS-PAGE，检测蛋白的表达。获得的可溶性PEDVN蛋白，其核苷酸序列如SEQIDNo.1，其氨基酸序列如SEQIDNo.2。实施例2猪流行性腹泻病毒抗体检测ELISA方法的建立（1）菌液培养表达抗原蛋白的菌种为BL21-tN，由PEDVt本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白，其核苷酸序列如SEQ ID No.1，蛋白序列如SEQ ID No.2。
【技术特征摘要】
1.一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白，其核苷酸序列如SEQIDNo.1，蛋白序列如SEQIDNo.2。2.一种权利要求1所述的可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白的应用，其特征在于，其用于猪流行性腹泻病毒抗体检测。3.根据权利要求2所述的一种可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白的应用，其特征在于，采用间接ELISA方法进行抗体检测，具体过程为：（1）抗原包被板的制备：用pH9.6的碳酸盐缓冲液将该可溶性猪流行性腹泻病毒N蛋白稀释后加入酶标反应板，孵育过夜；弃去孔中液体，用含0.05%Tween-20的PBS洗涤（PBST），洗涤后甩去孔中液体；（2）封闭：加入含5%马血清的PBST，孵育，弃去孔中液体；（3）加被检血清及对照血清：用血清稀释液稀释被检血清样品，加到抗原包被板反应孔中；同时设立阴性血清和阳性血清对照；盖好酶标板置室温反应1h，洗涤；（4）加酶标记抗体：加入血清稀释液稀释的酶标抗体，室温下作用1h，洗涤；（5）加底物缓冲液：每孔加新配制的TMB底物溶液，室温避光显色；（6）终止反应：观察阳性对照血清孔呈蓝色且阴性对照血清孔无色，终止反应；（7）酶标仪测定OD值：在波长450nm读数；（...
【专利技术属性】
技术研发人员：宋勤叶，朱卫霞，袁万哲，李丽敏，李潭清，
申请(专利权)人：河北农业大学，
类型：发明
国别省市：河北;13
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。