一种表达Mx-RNAis抗流感病毒感染的转基因鸡制造技术

本发明专利技术提供了一种通过慢病毒载体法获得的表达Mx-RNAis抗禽流感病毒感染的转基因鸡，实验证明表达Mx-RNAis基因转基因鸡携带的外源基因能够稳定遗传，且该转基因鸡能够显著抑制H5N1禽流感病毒的体内复制。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体地说，本专利技术涉及一种表达Mx-RNAis抗流感病毒感染的转基因鸡。
技术介绍
禽流感(AvianInfluenza，AI)是由A型流感病毒引起的禽类感染性疾病。禽流感病毒属于正黏病毒科、流感病毒属，其基因组含有8个单股负链RNA，共编码11种病毒蛋白，其中8个是病毒粒子的组成成分(HA、NA、NP、M1、M2、PB1、PB2和PA)。PA、PB1和PB2是组成A型流感病毒聚合酶的三种蛋白，它们以异源三聚体的形式存在，是转录和复制的关键。NP是位于流感病毒内部的重要结构蛋白，是构成病毒核衣壳的主要蛋白成分。此外，还能与RNA及PA、PB1和PB2形成RNP，在病毒的转录、复制及包装过程中发挥作用。禽流感的症状主要表现为呼吸道、消化道、生殖系统或神经系统异常，发病率较高，高致病性禽流感对家禽的致死率几乎为100％，不仅给养禽业、畜牧业带来巨大的经济损失，而且对公共健康也构成了严重威胁。A型流感病毒具有很强的变异能力，一种是因为病毒基因发生点突变的积累引起的抗原漂移，另一种是由于两种不同流感病毒共同感染一个细胞而发生基因重组，导致病毒蛋白的抗原性发生变化，因为病毒抗原性发生较大改变而称之为抗原转变。抗原漂移与抗原转变都会改变病毒表面蛋白抗原性，主要影响流感病毒血凝素为主，其次是神经氨酸酶(VijaykrishnaDetal.，2011)。因此本领域技术人员致力于开发对禽流感具有较强抗性的家禽品种，从而提高抗病能力。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种培育表达Mx-RNAis抗流感病毒感染的转基因鸡的方法及其应用。本专利技术的第一方面，提供了一种表达盒，所述表达盒包括Mx基因和siRNA编码序列，其中，所述siRNA特异性靶向A型禽流感病毒不同亚型的保守基因序列。在另一优选例中，所述保守基因序列选自下组：NP基因序列或其片段、PA基因序列或其片段、PB2基因序列或其片段、或其组合。在另一优选例中，靶向所述NP基因序列的siRNA编码序列包括SEQIDNO.:4所示的序列和/或其互补序列。在另一优选例中，靶向所述PA基因序列的siRNA编码序列包括SEQIDNO.:5所示的序列和/或其互补序列。在另一优选例中，靶向所述PB2基因序列的siRNA编码序列包括SEQIDNO.:6所示的序列和/或其互补序列。在另一优选例中，所述Mx基因为鸡Mx基因。在另一优选例中，所述鸡Mx基因序列如SEQIDNO.:7所示。在另一优选例中，所述表达盒还包括启动子元件，所述启动子元件启动所述Mx基因和siRNA编码序列的转录。在另一优选例中，所述启动子元件为CMV启动子或β-actin启动子。在另一优选例中，所述表达盒从5'端至3'端，依次包括可操作性连接的以下元件：(i)启动子元件；(ii)Mx基因基因序列；(iii)siRNA编码序列；和(iv)终止密码子。在另一优选例中，当所述表达盒整合入动物细胞后，使转基因动物转录特异性靶向A型禽流感病毒不同亚型的保守基因序列的siRNA，并且表达Mx蛋白。在另一优选例中，所述表达盒还包括(v)任选地位于各元件之间的连接序列。在另一优选例中，所述表达盒还包括供细胞选择的新霉素，或嘌呤霉素抗性基因。在另一优选例中，所述的标记基因可位于元件(i)之前、元件(i)与(ii)之间、或元件(iv)之后。在另一优选例中，所述动物为家禽，优选为鸡。本专利技术的第二方面，提供了一种载体，所述的载体含有本专利技术第一方面所述的表达盒。在另一优选例中，所述载体为慢病毒载体；优选地，所述慢病毒载体以p201慢病毒载体为骨架。在另一优选例中，所述载体中含有抗生素筛选标记。本专利技术的第三方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本专利技术第二方面所述的载体或染色体中整合有本专利技术第一方面所述的表达盒。在另一优选例中，所述宿主细胞为分离的。在另一优选例中，所述宿主细胞为家禽受精卵，所述家禽包括但限于：鸡、鸭、鹅、火鸡、鸵鸟。本专利技术的第四方面，提供了一种制备转基因家禽的方法，包括步骤：(i)提供一含有本专利技术第一方面所述的表达盒的载体或来自所述载体的本专利技术第一方面所述表达盒的核酸片段；(ii)将上一步骤所述的载体或所述的核酸片段转入家禽的受精卵中，获得经转染的受精卵；(iii)孵化上一步骤获得的经转染的受精卵，从而获得所述转基因家禽。在另一优选例中，所述家禽为鸡、鸭、鹅、火鸡、或鸵鸟。在另一优选例中，所述转基因家禽具有抗流感的能力。在另一优选例中，所述流感为H5N1流感病毒。在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(vi)将步骤(v)中获得的转基因家禽作为F0代，与野生型同品种家禽杂交，繁育F1代，从而获得F1代转基因哺乳动物。在另一优选例中，所述方法还包括步骤：(vii)利用步骤(vi)获得的F1代转基因家禽繁育获得F2代转基因家禽。在另一优选例中，所述步骤(ii)采用赤道开窗法，将所述载体通过显微注射针注射到受精卵胚盘下腔，获得经转染的受精卵。本专利技术的第五方面，提供了本专利技术第一方面所述的的表达盒、本专利技术第二方面所述的载体、或本专利技术第三方面所述的宿主细胞，在制备试剂中的用途，其特征在于，所述试剂用于制备非人哺乳动物。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1显示了HA试验中特异性miRNA对流感病毒增殖的影响；图2显示了各转染组流感病毒PB2基因的相对转录本水平；图3显示重组的pcDNA6.2EmGFP-Mx酶切鉴定结果；图4显示了HA试验分析Mx、RNAis与Mx-RNAis对流感病毒增殖的影响；图5是p201(pPRIME-CMV-MX-SR)载体图谱；图6转基因鸡感染H5N1禽流感病毒死亡率结果；图7显示感染流感病毒后，提取WT鸡和TG鸡肺脏病毒，进行病毒滴定结果；图8显示感染流感病毒后，提取WT鸡和TG鸡鼻拭子病毒，进行病毒滴定结果。具体实施方式本专利技术人通过广泛而深入的研究，获得一种培育具有显著禽流感抗性的转基因鸡的方法，所述方法将Mx基因和RNAi基因组成的构建物转染至鸡体内，培育出转基因鸡具有显著提高的抵抗H5N1禽流感病毒的能力。实验结果表明，同时转染Mx基因和RNAi基因的转基因鸡与仅转染Mx基因、或RNAi基因的鸡相比，具有显著更强的抗禽流感病毒的能力，显示了Mx基因和RNAi基因具有显著的协同效果。在此基础上，完成了本专利技术。在描述本专利技术之前，应当理解本专利技术不限于所述的具体方法和实验条件，因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案，并且不意图是限制性的，本专利技术的范围将仅由所附的权利要求书限制。除非另外定义，否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本专利技术所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用，在提到具体列举的数值中使用时，术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1％。例如，如本文所用，表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如，99.1、99.2、99.3、99.4等)。虽然在本专利技术的实施或测试中可以使用与本专利技术中所述相似或等价本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包括Mx基因和siRNA编码序列，其中，所述siRNA特异性靶向A型禽流感病毒不同亚型的保守基因序列。

【技术特征摘要】
1.一种表达盒，其特征在于，所述表达盒包括Mx基因和siRNA编码序列，其中，所述siRNA特异性靶向A型禽流感病毒不同亚型的保守基因序列。2.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述保守基因序列选自下组：NP基因序列或其片段、PA基因序列或其片段、PB2基因序列或其片段、或其组合；优选地，靶向所述NP基因序列的siRNA编码序列包括SEQIDNO.:4所示的序列和/或其互补序列；靶向所述PA基因序列的siRNA编码序列包括SEQIDNO.:5所示的序列和/或其互补序列；和/或靶向所述PB2基因序列的siRNA编码序列包括SEQIDNO.:6所示的序列和/或其互补序列。3.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述Mx基因为鸡Mx基因；优选地，所述鸡Mx基因序列如SEQIDNO.:1所示。4.如权利要求1所述的表达盒，其特征在于，所述表达盒还包括启动子元件，所述启动子元件启动所述Mx基因和siRNA编码序列的转...

【专利技术属性】
技术研发人员：孟庆文，王伟，陈洪岩，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23