一种基于离子液体的蛋白质组样品快速预处理方法技术

本发明专利技术涉及一种基于离子液体的蛋白质组样品快速预处理方法，使用含有离子液体的溶液提取生物样本中的蛋白质，并于离心超滤装置内原位进行蛋白质样品的快速预处理及蛋白质样品的纯化过程。该方法具有高效、高通量、高回收率的优点并可应用于健康或疾病生物体的细胞、组织及器官等生物样本中的可溶性蛋白质和/或膜蛋白质样品的分析中。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基于离子液体的蛋白质组样品快速预处理方法，可实现生物样本中蛋白质组的快速原位预处理及纯化，具有高效、高通量、高回收率的优点并可应用于健康和疾病生物体的细胞、组织及器官等生物样本中的可溶性蛋白质和/或膜蛋白质样品的分析中。
技术介绍
在传统的生物样本蛋白质样品预处理过程中，蛋白质提取体系有限的溶解能力及样品转移、除盐、冻干等步骤会导致膜蛋白质等低丰度蛋白质丢失严重；此外，操作步骤的繁琐耗时不利于生物样本的及时分析。因此，建立高效快捷的蛋白质样品预处理方法，包括蛋白质样品的提取、溶解和酶解，在实现高通量、高灵敏度、高准确度的蛋白质研究过程中发挥重要作用，进而利于推动疾病的发现与治疗上的深入研究。传统的蛋白质增溶剂包括十二烷基磺酸钠等表面活性剂及甲醇等有机溶剂，然而这些增溶剂难以同时实现优异的强疏水性蛋白溶解能力和优良的酶活兼容性，因此不满足生物样本蛋白质组的高效分析要求。近年来，离子液体由于其可设计性强、膜蛋白质溶解能力强和酶活兼容性好的优点，逐渐成为膜蛋白质溶解的新型溶剂。目前，有文献使用离子液体对膜蛋白质进行溶解，并使用高pH流动相及强阳离子固定相去除酶解产物中的离子液体(Zhao,Q；Fang,F；Liang,Y；Yuan,H.M；Yang,K.G；Wu,Q；Liang,Z；Zhang,L.H；Zhang,Y.K.Anal.Chem.2014,86,7544-7550.)。然而，该方法具有以下问题：1)未涉及生物样本中蛋白质样品的提取；2)未考察离子液体对可溶性蛋白质的样品预处理能力；3)样品预处理步骤繁琐，耗时长，除盐、冻干步骤中样品损失大。
技术实现思路
为了克服蛋白质样品预处理过程耗时长，操作繁琐，损失量大等不足，本专利技术提供一种基于离子液体的蛋白质组样品快速预处理方法，使用离子液体溶液提取生物样本中的蛋白质，并于离心超滤装置中集成了蛋白质的变性、还原、烷基化、酶解及样品纯化过程。同时，采用微波水浴辅助酶解，可有效降低酶解时间，提高酶解效率。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：(1)蛋白质提取液的配制：使用pH为7.5-14的碱性缓冲溶液(碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液或三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液)配制溶有体积浓度为0.1％-30％的离子液体溶液(阳离子部分为烷基链部分含2个碳和2个以上碳的咪唑类、吡啶类、季铵类、或季鏻类阳离子；阴离子部分为Cl-、Br-、I-、NO3-、ClO4-、AlCl4-、BF4-、PF4-、CF3COO-、CF3SO3-、(CF3SO2)2N-或SbF6-中的一种或二种以上)，即为蛋白质提取液；蛋白质提取液中加入或不加入辅助添加剂，辅助添加剂为质量体积浓度为0％-30％的十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、烷基糖苷、100(聚乙二醇辛基苯基醚)(TritonX-100)、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、RapiGestSF或乙基苯基聚乙二醇(NP-40d)等表面活性剂、摩尔浓度为0-20M的尿素、硫脲或盐酸胍等去垢剂、体积浓度为0％-100％的有机醇类或有机酸类等有机溶剂或摩尔浓度为0-1000mM的二硫苏糖醇、磷酸三氯乙酯或β-巯基乙醇等还原剂等中的一种或两种以上；(2)蛋白质样品的提取和溶解：向生物样品中加入步骤(1)中的蛋白质提取液，并进行机械裂解或高温孵育实现生物样本的裂解，以提取和溶解生物样品中的蛋白质；(3)蛋白质样品的变性及还原：将步骤(2)中所得的蛋白质样品溶液加入至离心超滤装置的超滤膜中实现蛋白质的原位富集，加入摩尔浓度为0-1000mM的二硫苏糖醇、磷酸三氯乙酯或β-巯基乙醇等还原剂等中的一种或两种以上的还原剂，在40-100℃水浴下孵育1-60min下同时进行蛋白质样品的变性及还原过程；(4)蛋白质样品的纯化：将步骤(3)中处理的样品溶液经离心后，向超滤膜中加入pH为7.5-14的碱性缓冲溶液或水溶液并离心，重复1-10次，去除蛋白质溶液中的离子液体及小分子杂质；(5)蛋白质样品的烷基化及酶解：向步骤(4)中离心后的超滤膜中加入以pH为7.5-9的碱性缓冲溶液为溶剂配制的烷基化溶液(碘代乙酸或碘乙酰胺)及胰蛋白酶溶液后，采用微波水浴辅助方法同时进行烷基化及酶解过程；(6)酶解肽段的收集：微波水浴结束后，将离心超滤装置进行离心，保留收集管中所得溶液，向超滤膜中加入蒸馏水后，再次进行离心，保留收集管中所得溶液，将两次收集管中所得溶液混合，即为所需的蛋白质酶解产物。本专利技术具有以下优点：1、样品损失小。使用溶解性能优异的离子液体溶液提取和溶解生物样本中的蛋白质，且蛋白质样品预处理过程包括蛋白质样品的变性、还原、烷基化、酶解及纯化过程皆在离心超滤装置中原位进行，有效减少样品转移造成的损失。2、可实现蛋白质样品的纯化。由于离心超滤装置中的超滤膜具有截留大分子的功能，可实现离子液体和小分子杂质的去除。3、通量高。蛋白质样品的变性及还原过程同时进行，烷基化及酶解过程微波辅助下同时进行，整个样品预处理过程可在2h内完成。4、处理全蛋白质组。使用蛋白质原位预处理方法可处理可溶性蛋白质和/或膜蛋白质。5、酶解效率高。酶解过程在微波水浴辅助下进行，酶解时间缩短至1min，酶量提高，从而提高酶解效率。6、处理微量样品。蛋白质样品酶解后加水进行冲洗，可有效增加酶解产物含量，同时降低样品中盐的浓度，减少了除盐步骤，进一步减少样品损失，利于微量样品的处理。附图说明图1为离心超滤装置示意图(管式超滤膜)；图中1：超滤膜，2：收集管；图2为蛋白质原位样品预处理流程图。图中3：蛋白质的提取和溶解，4：蛋白质的变性及还原，5、6：蛋白质样品的纯化，7：蛋白质的烷基化及酶解，8：样品的冲洗，9：酶解产物的收集。具体实施方式实施例11.蛋白质提取液的配制使用10mM碳酸氢铵缓冲溶液(ABC)(pH8.7)溶解氯化-1-十二烷基-3-甲基-咪唑(体积浓度为4％)，并使用该溶液配制体积摩尔浓度为100mM的二硫苏糖醇，得到蛋白质提取液。2.蛋白质样品的提取和溶解，变性及还原将消化的105个HeLa细胞(实验室自培养)(～10μg蛋白)置于含100μL步骤1中制备的蛋白质提取液的离心管中，在95℃水浴下反应5min。在16000×g转速下离心5min，取上清于离心超滤装置的超滤膜中。3.蛋白质样品的变性、还原及纯化步骤2中处理的样品在14000×g转速下离心10min，弃去收集管中废液。向超滤膜中加入200μL10mMABC，在14000×g转速下离心15min，弃去收集管中废液。重复三次。4.蛋白溶液的烷基化及酶解向步骤3中离心后的超滤膜中加入50μL10mM碘代乙酰胺(溶解于10mMABC)溶解的10μg胰蛋白酶溶液，将离心超滤装置转入盛有水的微波盒中并将微波盒放入微波炉中，功率为800W，选择开2秒停1秒的加热时间间隔模式，微波水浴下酶解30s。5.肽段的收集步骤4中处理的样品在14000×g转速下离心10min，保留收集管中所得溶液。向超滤膜中加入100μL蒸馏水进行冲洗，14000×g转速下离心10min，保留收集管中所得溶液，并将两次收集管中所得溶液混合。6.质谱检测步骤5中处理得到的HeLa细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于离子液体的蛋白质组样品快速预处理方法，其特征在于：使用含离子液体的溶液提取生物样本中的蛋白质，所得蛋白质样品的快速预处理及纯化过程，皆在离心超滤装置中原位进行，具体包括：(1)使用碱性缓冲溶液配制离子液体溶液，即为蛋白质提取液，向生物样本中加入上述蛋白质提取液，并将生物样本进行裂解，以提取生物样本中的蛋白质，离心取上清，得到蛋白质样品溶液；(2)将步骤(1)中所得的蛋白质样品溶液加入至离心超滤装置的超滤膜中，加入还原剂，高温孵育；(3)将步骤(2)中处理的样品溶液经离心后弃去废液，并向超滤膜中加入碱性缓冲溶液或水溶液，离心弃去废液，重复上述操作，得到纯化的蛋白质样品；(4)向步骤(3)中最后一次离心后的超滤膜中加入以pH为7.5‑9的碱性缓冲溶液为溶剂配制的烷基化溶液及胰蛋白酶溶液后，进行烷基化和蛋白质酶解；(5)酶解完成后，离心，保留离心超滤装置的收集管内所得溶液；向超滤膜中加入蒸馏水，将离心超滤装置进行离心，保留收集管内所得溶液，将两次收集管中所得溶液混合，即为所需的蛋白质预处理产物。

【技术特征摘要】
1.一种基于离子液体的蛋白质组样品快速预处理方法，其特征在于：使用含离子液体的溶液提取生物样本中的蛋白质，所得蛋白质样品的快速预处理及纯化过程，皆在离心超滤装置中原位进行，具体包括：(1)使用碱性缓冲溶液配制离子液体溶液，即为蛋白质提取液，向生物样本中加入上述蛋白质提取液，并将生物样本进行裂解，以提取生物样本中的蛋白质，离心取上清，得到蛋白质样品溶液；(2)将步骤(1)中所得的蛋白质样品溶液加入至离心超滤装置的超滤膜中，加入还原剂，高温孵育；(3)将步骤(2)中处理的样品溶液经离心后弃去废液，并向超滤膜中加入碱性缓冲溶液或水溶液，离心弃去废液，重复上述操作，得到纯化的蛋白质样品；(4)向步骤(3)中最后一次离心后的超滤膜中加入以pH为7.5-9的碱性缓冲溶液为溶剂配制的烷基化溶液及胰蛋白酶溶液后，进行烷基化和蛋白质酶解；(5)酶解完成后，离心，保留离心超滤装置的收集管内所得溶液；向超滤膜中加入蒸馏水，将离心超滤装置进行离心，保留收集管内所得溶液，将两次收集管中所得溶液混合，即为所需的蛋白质预处理产物。2.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：步骤(1)中所述的生物样本为健康或疾病生物体的生物大分子、细胞、组织或器官样本中的一种或二种以上。3.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：步骤(1)中所述的蛋白质提取液中，离子液体的阳离子部分为烷基链部分含2个以上碳的咪唑类、吡啶类、季铵类、或季鏻类阳离子；阴离子部分为Cl-、Br-、I-、NO3-、ClO4-、AlCl4-、BF4-、PF4-、CF3COO-、CF3SO3-、(CF3SO2)2N-或SbF6-中的一种或二种以上；质量体积浓度按离子液体的质量(g)与碱性缓冲溶液的体积(mL)之比计为0.1％-30％。4.按照权利要求1所述的预处理方法，其特征在于：步骤(1)中所述组织等生物样本的质量与蛋白质提取液的体积比例为0.01mg/mL-10g/mL；细胞等生物样本的数量与蛋白质提取液的体积比例为10-109个/mL；所述的蛋白质提取液中，加入或不加入辅助添加剂；上述辅助添加剂为表面活性剂、去垢剂、有机溶剂或还原剂中的一种或两种以上；上述表面活性剂为十二烷基磺酸钠、脱氧胆酸钠、烷基糖苷、100(聚乙二醇辛基苯基醚)(TritonX-100)、3-[3-(胆酰胺丙基)二甲氨基]丙磺酸内盐(CHAPS)、RapiGestSF或乙基苯基聚乙二醇(NP-40d)中的一种或二种以上，质量体积浓度按表面活性剂的质量(g)与碱性缓冲溶液的体积(mL)之比计为0％-30％；上述去垢剂为尿素、硫脲或盐酸胍中的一种或二种或三种，摩尔浓度按去垢剂的物质的量与碱性缓冲溶液的体积之比计为0-20M；上述有机溶剂为有机醇类或有机酸类中的一种或二种以上，体积浓度按有机溶剂与碱性缓冲溶液的体积之比计为0％-100％；上述还原剂为二硫苏糖醇、磷酸三氯乙酯或β-巯基乙醇中的一种或二种或三种，摩尔浓度按还原剂的物质的量与碱性缓冲溶液的体积之比计为0-1000mM；步骤(1)中所述的蛋白质提取液中，碱性缓冲溶液为pH为7.5-14的碳酸氢铵缓冲盐溶液、磷酸缓冲盐溶液...

【专利技术属性】
技术研发人员：张丽华，方菲，赵群，杨开广，张玉奎，
申请(专利权)人：中国科学院大连化学物理研究所，
类型：发明
国别省市：辽宁;21