一种用于大量扩增PD‑1基因重组活化T细胞的培养基、试剂盒及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种PD‑1基因重组活化T细胞培养基、试剂盒及其应用，该培养基包含：基础培养基，所述基础培养基适于PD‑1基因重组活化T细胞生成；OKT3；IL‑2；PHA；IL‑4；GM‑CSF。利用本发明专利技术的培养基，在无需加入异体血清的条件下，即能够将人PD‑1基因重组活化T细胞大量扩增，且快速高效、经济简便、效果稳定。本发明专利技术提供了一种能够经济、简便、高效地将自体或脐带血T细胞转变为PD‑1基因重组活化的T细胞并且可以大量增殖的培养基、试剂盒及其应用，提高了PD‑1基因重组活化T细胞的转染效率、促进了转染后T细胞的扩增速度、减少了扩增时间，从而提高了该活化T细胞对肿瘤或其它相关疾病的治疗作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术及细胞治疗的技术工程领域，具体涉及一种PD-1基因重组活化T细胞培养基、试剂盒及其应用。详细内容包含：培养基、试剂盒以及大量扩增PD-1基因重组活化T细胞中的方法。
技术介绍
目前，在肿瘤细胞免疫治疗中，T细胞和DC细胞是抗肿瘤细胞免疫的核心角色，然而，目前报道的这些免疫细胞普遍存在着培养成本高、扩增数量有限(扩增数量一般可在(1-3)×109)、扩增时间长、转染效率不稳定等不足，直接影响其抗肿瘤的效果。将自体或脐带血来源的T细胞转染为PD-1基因重组活化T细胞，并大量扩增，从而应用于临床研究是肿瘤免疫治疗研究的重要内容之一。专利申请201610083007.3(名称：PD-1基因重组病毒质粒及构建、重组逆转录病毒Lenti-PD-1-Puro及包装与应用)提出了一种有效的途径，可通过采用该专利申请获得的重组逆转录病毒质粒Lenti-PD-1-Puro体外感染T细胞，从而达到敲除T细胞上PD-1受体，即获得PD-1基因重组活化T细胞。但是为能够实现该方法的临床有效应用，对该PD-1基因重组活化T细胞的有效的规模化培养则成为了主要难题。
技术实现思路
本专利技术的目的即是为提高PD-1基因重组活化T细胞的转染效率、促进转染后T细胞的扩增速度、减少扩增时间，提供一种能够经济、简便、高效地将自体或脐带血T细胞转变为PD-1基因重组活化的T细胞并且可以大量增殖的培养基、试剂盒及其应用，从而提高该活化T细胞对肿瘤或其它相关疾病的治疗作用。本专利技术的一种用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的培养基，包含有：基础培养基，所述基础培养基为1640培养基，还包含有：80-120ng·ml-1的OKT3、800-1200U·ml-1的IL-2、80-120ug·ml-1的PHA、8-10ng·ml-1的IL-4、800-1200U·ml-1的GM-CSF。优选的，上述所述的用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的培养基中，可包含有：95-105ng·ml-1的OKT3，960-1060U·ml-1的IL-2，95-105ug·ml-1的PHA，8-10ng·ml-1的IL-4，960-1060U·ml-1的GM-CSF；更优选的，包含有98-102ng·ml-1的OKT3，980-1020U·ml-1的IL-2，98-102ug·ml-1的PHA，8-10ng·ml-1的IL-4，980-1020U·ml-1的GM-CSF，最优选的，包含有100ng·ml-1的OKT3，1000U·ml-1的IL-2，100ug·ml-1的PHA，10ng·ml-1的IL-4，1000U·ml-1的GM-CSF。本专利技术还提供了一种用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的试剂盒，该试剂盒包含有上述所述的用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的培养基。本专利技术还提供了上述所述的用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的培养基或试剂盒的一种应用，其包括步骤：PD-1基因重组活化T细胞的预培养、PD-1基因重组活化T细胞的扩增培养；所述预培养是指通过Ficoll两步分离法从自体T细胞或脐带血来源T细胞分离出单个核细胞，经培养孵育后，搜集悬浮细胞，采用PD-1基因重组病毒Lenti-PD-1-Puro进行病毒感染，离心培养获得PD-1基因重组活化的T细胞；所述扩增培养是指将预培养获得的PD-1基因重组活化的T细胞置于本专利技术的培养基接种培养。优选的，上述所述应用中，所述预培养具体是为：将人自体T细胞或脐带血来源T细胞利用淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞，置于1640培养基，37℃、5％CO2孵育2小时后搜集悬浮细胞，将含PD-1基因重组病毒质粒Lenti-PD-1-Puro的病毒培养基与本专利技术的培养基按1:1(v/v)混合后感染T细胞，按感染复数5:1，调整细胞浓度为(1.0-1.2)×106ml-1，同时加入polybrener10ug/ml增加感染效率，感染过夜后离心T细胞，并更换新鲜的本专利技术的培养基继续培养，即为PD-1基因重组活化的T细胞。所述含PD-1基因重组病毒质粒Lenti-PD-1-Puro的病毒培养基源自中国专利申请号201610083007.3实施例所得。优选的，上述所述应用中，所述PD-1基因重组活化T细胞的扩增培养是为：将预培养获得的PD-1基因重组活化的T细胞置于本专利技术的培养基接种于225cm2培养瓶中，接种密度为3～5×106PD-1基因重组活化T细胞/孔，2-3日半量换液。本专利技术还提供了上述所述的用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的培养基或试剂盒的另一种应用，其包括步骤：PD-1基因重组活化T细胞和DC细胞的预培养、PD-1基因重组活化T细胞和DC细胞的共培养；所述预培养是指通过Ficoll两步分离法从自体T细胞或脐带血来源T细胞分离出单个核细胞，经培养孵育后，收集贴壁细胞即DC细胞进行培养，并搜集悬浮细胞采用PD-1基因重组病毒Lenti-PD-1-Puro进行病毒感染，离心培养获得PD-1基因重组活化的T细胞；所述共培养是指将预培养获得的PD-1基因重组活化的T细胞和DC细胞置于本专利技术的培养基接种培养。优选的，上述所述应用中，所述预培养是为：将人自体T细胞或脐带血来源T细胞利用淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞，置于1640培养基，37℃、5％CO2孵育2小时后收集贴壁细胞即DC细胞，用含有1000U.ml-1的GM-CSF和10ng.ml-1的IL-4的1640培养基继续培养，第3天和第5天半量置换培养基，将培养第5天的DC细胞用终浓度为10μmol/L的唑来膦酸预处理48小时后收集，生理盐水洗涤1次，获得预培养的DC细胞；搜集悬浮细胞，将含PD-1基因重组病毒质粒Lenti-PD-1-Puro的病毒培养基(专利申请号201610083007.3实施例所得)与权利要求1或2所述的培养基按1:1(v/v)混合后感染T细胞，按感染复数5:1，调整细胞浓度为(1.0-1.2)×106ml-1，同时加入polybrener10ug/ml增加感染效率，感染过夜后离心T细胞，并更换新鲜的权利要求1或2所述的培养基继续培养，即为PD-1基因重组活化的T细胞。优选的，上述所述应用中，所述共培养是为：将预培养获得的PD-1基因重组活化的T细胞和DC细胞置于本专利技术的培养基接种于225cm2培养瓶中，接种密度为3～5×106PD-1基因重组活化T细胞/孔，用本专利技术的培养基进行培养，此后2-3日半量换液。优选的，上述所述应用中，所述共培养是将DC细胞与PD-1基因重组活化的T细胞按细胞数比1：100混合培养，培养基为本专利技术所述培养基，培养条件37℃，5％CO2细胞培养箱中培养。利用本专利技术的培养基，在无需加入异体血清及其他活化T细胞因子的条件下可以大量扩增PD-1基因重组活化的T细胞，即能够将人PD-1基因重组活化T细胞和DC细胞同时大量扩增，且该培养基的诱导方法快速高效、经济简便、效果稳定。其中，需要说明的是，本文中所用的术语“PD-1基因重组活化T细胞”是利用包装好的重组病毒质粒LentivirusPD-1-Puro(来源于中国专利申请号：201610083007.3)导入T细胞，从而达到敲除本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于大量扩增PD‑1基因重组活化T细胞的培养基，包含有：基础培养基，所述基础培养基为1640培养基，还包含有：80‑120ng·ml‑1的OKT3、800‑1200U·ml‑1的IL‑2、80‑120ug·ml‑1的PHA、8‑10ng·ml‑1的IL‑4、800‑1200U·ml‑1的GM‑CSF。

【技术特征摘要】
1.一种用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的培养基，包含有：基础培养基，所述基础培养基为1640培养基，还包含有：80-120ng·ml-1的OKT3、800-1200U·ml-1的IL-2、80-120ug·ml-1的PHA、8-10ng·ml-1的IL-4、800-1200U·ml-1的GM-CSF。2.如权利要求1所述的用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的培养基，其特征在于，包含有：95-105ng·ml-1的OKT3、960-1060U·ml-1的IL-2、95-105ug·ml-1的PHA、8-10ng·ml-1的IL-4、960-1060U·ml-1的GM-CSF。3.—种用于大量扩增PD-1基因重组活化T细胞的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1或2所述的培养基。4.权利要求1-2任一项所述培养基或者权利要求3所述试剂盒的应用，其特征在于，包括步骤：PD-1基因重组活化T细胞的预培养、PD-1基因重组活化T细胞的扩增培养；所述预培养是指通过Ficoll两步分离法从自体T细胞或脐带血来源T细胞分离出单个核细胞，经培养孵育后，搜集悬浮细胞，采用PD-1基因重组病毒Lenti-PD-1-Puro进行病毒感染，离心培养获得PD-1基因重组活化的T细胞；所述扩增培养是指将预培养获得的PD-1基因重组活化的T细胞置于权利要求1或2所述的培养基接种培养。5.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述预培养是为：将人自体T细胞或脐带血来源T细胞利用淋巴细胞分离液分离，收集单个核细胞，置于1640培养基，37℃、5％CO2孵育2小时后搜集悬浮细胞，将含PD-1基因重组病毒质粒Lenti-PD-1-Puro的病毒培养基与权利要求1或2所述的培养基按1:1混合后感染T细胞，按感染复数5:1，调整细胞浓度为(1.0-1.2)×106ml-1，同时加入polybrener10ug/ml增加感染效率，感染过夜后离心T细胞，并更换新鲜的权利要求1或2所述的培养基继续培养，即为PD-1基因重组活化的T细胞。6.如权利要求4所述应用，其特征在于，所述PD-1基因重组活化T细胞的扩增培养是为：将预培养获得的PD-1基因重组活化的T细胞置于权利要求1或2所述的培养基接种于...

【专利技术属性】
技术研发人员：孙昌秀，
申请(专利权)人：安徽柯顿生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34