一种DNA疫苗浸泡免疫预防鳜鱼ISKNV的方法技术

本发明专利技术属于水产养殖和医药生物工程领域，具体涉及一种DNA疫苗浸泡免疫预防鳜鱼ISKNV的方法。所述方法包括：以ISKNV核酸为模板，利用引物扩增MCP基因序列，将PCR产物克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，构建得到DNA疫苗真核表达质粒pcMCP；将鳜鱼浸泡在免疫浸泡液中进行DNA疫苗浸泡免疫；免疫后的鳜鱼置于25℃环境下、投喂鲮鱼进行恒温养殖。本发明专利技术通过构建DNA疫苗并采用DNA疫苗浸泡免疫的方式对鳜鱼苗进行免疫，经试验证明，采用本发明专利技术所述方法免疫后，能够有效激活鳜鱼的体液免疫，有效提高鳜鱼脾脏中Mx mRNA的表达量从而提高抗病毒能力，能够显著降低ISKNV病毒感染鳜鱼的死亡率。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于水产养殖和医药生物工程领域，具体涉及一种DNA疫苗浸泡免疫预防鳜鱼ISKNV的方法。
技术介绍
在水产养殖中，病毒性疾病造成损失呈上升趋势，病毒性疾病大多缺乏针对性的治疗药物和手段，疫苗防控作为疾病控制方法，越来越受到水产养殖业的重视。但目前大量使用的注射免疫方式使得水产疫苗在水产养殖业的应用和推广受到了很大的限制。因此，开发成本低廉、免疫方式简便的疫苗对水产养殖业尤为重要。研究表明，基于粘膜系统的疫苗能够提高病原体感染后实验动物的生存。DNA疫苗不仅能够通过粘膜系统使鱼体产生足够的免疫保护力，同时还能够刺激机体非特异性免疫产生额外的免疫保护。鳜鱼病毒病对我国的鳜鱼养殖业造成很大危害，其主要病原是传染性脾肾坏死病毒(infectiousspleenandkidneynecrosisvirus,ISKNV)。目前，该病没有针对性的特效药物，仍以预防为主，通过水质调节，免疫增强为主，疫苗防治为鳜鱼养殖业急需。由于鳜鱼是肉食性鱼类，性格暴躁，只吃活鱼，口服或注射的免疫方式很难在鳜鱼养殖中使用。疫苗浸泡免疫是鳜鱼免疫的唯一选择。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术中存在的不足，目的在于提供一种DNA疫苗浸泡免疫预防鳜鱼ISKNV的方法。为实现上述专利技术目的，本专利技术所采用的技术方案为：一种DNA疫苗浸泡免疫预防鳜鱼ISKNV的方法，包括如下步骤：(1)DNA疫苗的构建：以ISKNV核酸为模板，利用引物扩增MCP基因全长序列，并将PCR产物MCP基因克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，构建得到DNA疫苗真核表达质粒pcMCP；(2)DNA疫苗浸泡免疫：取1～4厘米长的鳜鱼浸泡在免疫浸泡液中进行DNA疫苗浸泡免疫，所述免疫浸泡液为含有pcMCP真核表达质粒的磷酸盐缓冲液；(3)将浸泡免疫后的鳜鱼置于25℃环境下、投喂鲮鱼进行恒温养殖。上述方案中，所述引物为：P1：5’-CGGGTACCATGGCTGCAATCTCA-3’P2：5’-GCGAATTCTTACAGGATAGGGAAGC-3’。上述方案中，所述免疫浸泡液中pcMCP真核表达质粒的浓度为大于100ng/mL。上述方案中，所述1～4厘米的鳜鱼在进行DNA疫苗浸泡免疫之前，先被禁食8h～14h。上述方案中，所述DNA疫苗浸泡免疫的时间为大于30min。为方便生产上使用，可将本专利技术所述方法简化，简化后的方法更为方便渔民实际操作：(1)在鳜鱼苗下塘前，鳜鱼在种苗厂装活鱼充氧车(或氧气袋)，根据运输体积含量加入磷酸盐平衡后的DNA疫苗，确保pcMCP质粒浓度大于100ng/ml。(2)鳜鱼苗运输到塘边后，确保免疫时间大于30分钟。(3)鳜鱼苗下塘时确保鱼苗运输温度和池塘温度接近。本专利技术的有益效果：本专利技术通过构建DNA疫苗并采用DNA疫苗浸泡免疫的方式对鳜鱼苗进行免疫用以预防鳜ISKNV感染，经试验证明，采用本专利技术所述方法免疫后，能够有效激活鳜鱼的体液免疫(IgM表达量显著增加)，能够有效提高鳜鱼脾脏中MxmRNA的表达量从而提高鳜鱼的抗病毒能力，能够显著降低ISKNV病毒感染的鳜鱼的死亡率。附图说明图1为PCR检测pcMCP质粒的电泳结果图，其中M为DL2000；1-2为MCP基因；3为阴性对照。图2为间接荧光免疫检测重组质粒在EPC细胞中表达的结果图，其中1为转染空质粒pcDNA3.1(+)的EPC细胞；2为转染pcMCP的EPC细胞。图3为DNA疫苗浸泡免疫后鳜鱼脾脏中IgMmRNA的表达结果。图4为DNA疫苗浸泡免疫后鳜鱼脾脏中MxmRNA的表达结果。图5为不同免疫组攻毒实验后的鳜鱼的累计死亡率结果，其中pcDNA3.1和PBS为对照组，pcMCP为免疫组。具体实施方式为了更好地理解本专利技术，下面结合实施例进一步阐明本专利技术的内容，但本专利技术的内容不仅仅局限于下面的实施例。实施例1DNA疫苗的构建及鉴定1、DNA疫苗的构建：(1)以ISKNV核酸为模板，利用引物P1(如表3所示)和P2(如表3所示)PCR扩增得到MCP基因全长序列(如SEQNO.1所示)，其中下划线表示限制性内切酶KpnI和EcoRI的酶切位点。PCR反应体系如下表1，PCR反应条件如下表2所示。表1PCR反应体系(25μL)反应体系用量(μL)10×TaqPCRbuffer2.52.5mMdNTPMix0.420μMP10.420μMP20.4TaqDNA聚合酶0.3DNA模版2ddH2O19Total25表2PCR反应条件变性退火延伸循环数94℃,3min194℃,30s58℃,45s72℃,1min30s3072℃,10min1(2)将PCR产物MCP基因克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，构建得到DNA疫苗真核表达质粒pcMCP。2、重组质粒PCR鉴定采用引物P1和引物P2对上述构建获得的DNA疫苗真核表达质粒pcMCP进行PCR鉴定和测序，PCR产物经电泳结果如图1所示：大小为1362bp的ISKNVMCP基因成功克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)。3、免疫荧光方法检测转染重组质粒的基因表达脂质体Lipofectamine2000介导上述构建获得的真核表达质粒pcMCP转染EPC细胞，转染后72h进行间接荧光免疫试验检测基因在细胞中的表达情况，同时用pcDNA3.1(+)空质粒转染EPC细胞作为对照，实验结果如图2所示：转染真核表达质粒pcMCP的EPC细胞胞质中可观察到红色荧光，而用pcDNA3.1(+)空质粒转染EPC细胞的对照组中未发现任何荧光，这表明成功构建的真核表达质粒pcMCP能够在EPC细胞中表达。实施例2DNA疫苗浸泡免疫效果的检测1、免疫相关基因的检测利用荧光定量RT-PCR分析免疫鳜鱼鱼体免疫相关基因(Mx，IgM)的表达差异。分别在浸泡免疫后12h、24h、48h、72h、96h采样，每组随机取3尾鱼，解剖取其脾脏组织，用Trizol(Invitrogen)提取样品中的总RNA，经DNAseI消化后，反转录获得cDNA第一链。按照RealtimePCRMasterMix(SYBRGreen)试剂盒中的操作说明，在ABplusone荧光定量PCR仪上对所取的实验样品进行Real-timePCR，引物见表3。表3质粒构建引物以及实时定量PCR基因表达分析引物实时定量PCR检测DNA疫苗浸泡免疫对鳜鱼脾脏中IgMmRNA表达变化,结果如图3所示：在浸泡免疫后48h内，IgMmRNA含量与对照组几乎没有变化，72h后IgMmRNA表达量逐步升高，72hIgMmRNA表达量是PBS对照组的2.04倍，96hIgMmRNA表达量是PBS对照组的3.05倍，这表明DNA疫苗浸泡免疫能够有效激活鳜鱼体液免疫，表达IgM。实时定量PCR检测DNA疫苗浸泡免疫对鳜鱼脾脏中MxmRNA表达变化，结果如图4所示：浸泡免疫后12h和24h，MxmRNA脾脏中的含量略低于PBS对照组，72h和96h的MxmRNA含量分别是PBS对照组的1.45倍和2.02倍，这表明，Mx基因表达量在浸泡免疫组随时间的增加含量逐步增加(Mx(Myxovirusresistance)蛋白是一类由I型干扰素(IFN)诱导表达的抗病毒蛋白，当机体或细胞受到病毒感染时，能与其它本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA疫苗浸泡免疫预防鳜鱼ISKNV的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）DNA疫苗的构建：以ISKNV核酸为模板，利用引物扩增MCP基因全长序列，并将PCR产物MCP基因克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，构建得到DNA疫苗真核表达质粒pcMCP；（2）DNA疫苗浸泡免疫：取1~4厘米长的鳜鱼浸泡在免疫浸泡液中进行DNA疫苗浸泡免疫，所述免疫浸泡液为含有pcMCP真核表达质粒的磷酸盐缓冲液；（3）将浸泡免疫后的鳜鱼置于25℃环境下、投喂鲮鱼进行恒温养殖。

【技术特征摘要】
1.一种DNA疫苗浸泡免疫预防鳜鱼ISKNV的方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）DNA疫苗的构建：以ISKNV核酸为模板，利用引物扩增MCP基因全长序列，并将PCR产物MCP基因克隆到真核表达质粒pcDNA3.1(+)中，构建得到DNA疫苗真核表达质粒pcMCP；（2）DNA疫苗浸泡免疫：取1~4厘米长的鳜鱼浸泡在免疫浸泡液中进行DNA疫苗浸泡免疫，所述免疫浸泡液为含有pcMCP真核表达质粒的磷酸盐缓冲液；（3）将浸泡免疫后的鳜鱼置于25℃环境下、投喂鲮鱼进行恒温养殖。2.根据权利要求1所述DNA疫苗浸泡免疫预防鳜鱼ISKNV的方法，其特征在于，所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：周伟东，喻婷，刘奕，张立强，邓平，艾桃山，徐洪亮，
申请(专利权)人：武汉市农业科学技术研究院水产科学研究所，
类型：发明
国别省市：湖北;42