一种呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原、人工抗原及其应用制造技术

本发明专利技术属于免疫检测技术领域，具体公开了一种呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原、人工抗原及其应用。所述呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原具有式（I）所示结构，将呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原与载体蛋白偶联即可得到呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原，用上述人工抗原免疫实验动物，使其机体产生特异地针对呫吨聚氨基甲酸乙酯的抗体；所述抗体可以特异性识别氨基甲酸乙酯占吨醇衍生物—呫吨聚氨基甲酸乙酯，用于间接检测食品中氨基甲酸乙酯的含量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫检测
，具体地，涉及一种呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原、人工抗原及其应用。
技术介绍
氨基甲酸乙酯(Ethylcarbamate，简称EC)，又名尿烷或乌拉坦，分子式为C3H7NO2，是一种无色、无味的粉末状晶体，不易挥发(沸点182-184℃)，易溶于水和乙醇，是发酵食品特别是酒精饮料中自然形成的一种化学污染物，对人类健康具有致癌的潜在威胁；自1943年Nettleship等发现EC可以导致小鼠细胞癌变和肿瘤的形成后，EC的致癌性在许多模式动物中(大鼠、小鼠、仓鼠和猴子等)都得到了证明。基于这些实验结果，1974年被国际癌症研究机构(IARC)划为2B级的致癌化合物。此后，研究人员又发现EC也可以直接诱发人的肝癌，因此，IARC在2007年将EC的致癌等级由2B级提升到了2A级(与甲醛同级)。随着检测技术的发展，众多酒精饮品中陆续检测出EC，越来越多的国家对酒精饮品中的EC残留都做出严格规定(表1)。目前，我国暂未正式公布EC限量标准，但食品安全部门已经在认真的考虑中，相信不久之后就会出台相关的EC限量条例。表1各国对酒精饮品中EC限量标准(μg/L)目前国内外检测氨基甲酸乙酯的常用方法主要集中在色谱、质谱等物化手段定性定量，但这些方法样品预处理要求高、步骤复杂、操作需专业人员、检测费用高、所依赖仪器昂贵复杂、费时费力，很难适应许多场合快速检测的需要，在应用上不能广泛推广。基于抗原抗体特异性结合的的免疫学检测方法具有简便、快速、灵敏、高特异性等优点，越来越被关注。国际权威学术刊物将其列为近年来首位优先发展的新分析技术。但是，目前尚无可用于免疫检测的氨基甲酸乙酯半抗原、抗原和抗体的相关报道，使得氨基甲酸乙酯ELISA检测方法暂时还未建立。
技术实现思路
本专利技术针对现有技术的上述不足，提供一种呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原。本专利技术的另一个目的是提供一种呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原。本专利技术的另一个目的是提供上述呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原的制备方法。本专利技术还有一个目的是提供上述呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原的制备方法。本专利技术还有一个目的是提供上述呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原在间接检测氨基甲酸乙酯中的应用。本专利技术还有一个目的是提供一种间接检测氨基甲酸乙酯的方法。为了实现上述目的，本专利技术是通过以下方案予以实现的。一种呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原，其结构式如式(I)所示：式(I)；其中，n＝0～6。由上述半抗原结构可以看出，本专利技术针对氨基甲酸乙酯的呫吨醇衍生物(呫吨聚氨基甲酸乙酯)设计和制备得到的半抗原在分子结构、立体化学和电子分布上与呫吨聚氨基甲酸乙酯相似，半抗原结构中的连接臂不易于诱导产生“臂抗体”，并且使用了一定长度的饱和碳链，使机体更易于识别。一种呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原，其结构式如式(Ⅱ)所示：式(Ⅱ)；其中，n＝0～6。式(I)所示呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原的制备方法，包括以下步骤：(1)将氨基甲酸乙酯与式(Ⅲ)所示带羧基的呫吨醇衍生物在室温条件下于含醋酸的甲醇中进行亲核取代反应；(2)蒸干甲醇，用稀盐酸洗涤得到的沉淀，烘干即得半抗原；式(Ⅲ)；其中n＝0～6。步骤(1)所述带羧基的呫吨醇衍生物优选为9-羟基-9H-呫吨-3-羧酸或2-(9-羟基-9H-呫吨-4-基)乙酸。式(Ⅱ)所示的呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原的制备方法，将呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原偶联载体蛋白得到人工抗原，具体包括以下步骤：(1)式(I)所示的将呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原与N,N’-二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)反应形成活泼酯；(2)将活泼酯滴加入载体蛋白溶液中，反应过夜；(3)偶联有氨基甲酸乙酯呫吨醇衍生物半抗原的蛋白经过3天的透析纯化得到目标人工抗原。所述载体蛋白为免疫原载体蛋白或包被原载体蛋白。优选地，所述免疫原载体蛋白为牛血清蛋白(BSA)，包被原载体蛋白为鸡卵清白蛋白(OVA)。本专利技术还提供了呫吨聚氨基甲酸乙酯抗体的制备方法，即用式(Ⅱ)所示的人工抗原免疫实验动物，使其机体产生特异地针对呫吨聚氨基甲酸乙酯的抗体，所述抗体是能与呫吨聚氨基甲酸乙酯发生特异性免疫反应的免疫球蛋白G。作为优选实施方式，呫吨聚氨基甲酸乙酯抗体的制备方法包括如下步骤：(1)将呫吨聚氨基甲酸乙酯抗原配合福式佐剂免疫实验动物；(2)免疫4次后抽取血液，分离血清；(3)血清经过抗体纯化步骤得到目标抗体。本专利技术还提供了如上所述半抗原、人工抗原、抗体在间接检测氨基甲酸乙酯中的应用。与现有技术相比，本专利技术具有以下有益效果：(1)引入3个芳香环结构使得氨基甲酸乙酯的结构特征明显增强，有利于刺激动物免疫应答产生特异性更强、灵敏度更高的抗体；(2)呫吨醇与氨基甲酸乙酯的氨基在室温条件下，快速、高效进行亲核取代反应，衍生效率高，时间短，重复性好；(3)本专利技术提供的氨基甲酸乙酯的快速检测方法最低检测限可达0.1ng/mL。附图说明图1为半抗原BⅠ(n＝0)及其免疫抗原、包被抗原紫外扫描图。图2为半抗原BⅠ(n＝1)及其免疫抗原、包被抗原紫外扫描图。图3为以BⅠ(n＝0)为半抗原所制备的抗体对呫吨聚氨基甲酸乙酯的抑制曲线。图4为以BⅠ(n＝1)为半抗原所制备的抗体对呫吨聚氨基甲酸乙酯的抑制曲线。具体实施方式下面结合说明书附图和具体实施例对本专利技术作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本专利技术，并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。实施例1氨基甲酸乙酯半抗原BⅠ(n＝0)制备方法178mg氨基甲酸乙酯溶于5mL1M的乙酸；626mg9-羟基-9H-呫吨-3-羧酸溶于20mL甲醇；混合上述溶于，室温搅拌1小时。向混合液中加10mL蒸馏水，旋转蒸发除去反应混合液中的甲醇，过滤，沉淀用0.1M稀盐酸洗涤，蒸馏水洗涤，烘干得424mg灰色固体，即目标半抗原XEC-313-3，结构式如(Ⅳ)所示。式(Ⅳ)。ESI-MS分析(negative)m/z312[M+H]–；1HNMR(600MHz,DMSO)δ8.21(d,J＝8.8Hz,1H),7.71(dd,J＝8.0,1.6Hz,1H),7.61(d,J＝1.6Hz,1H),7.51(d,J＝8.0Hz,1H),7.40(d,J＝7.3Hz,1H),7.35(td,J＝7.9,1.5Hz,1H),7.18(t,J＝7.4Hz,3H),5.99(d,J＝8.6Hz,1H),4.06(q,J＝7.0Hz,2H),1.18(t,J＝7.1Hz,3H).实施例2氨基甲酸乙酯半抗原BⅠ(n＝1)的制备方法178mg氨基甲酸乙酯溶于5mL1M的乙酸；654mg2-(9-羟基-9H-呫吨-4-基)乙酸溶于20mL甲醇；混合上述溶于，室温搅拌1小时。向混合液中加10mL蒸馏水，旋转蒸发除去反应混合液中的甲醇，过滤，沉淀用0.1M稀盐酸洗涤，蒸馏水洗涤，烘干得402mg灰色固体，即目标半抗原XEC-327-4，结构式如(Ⅴ)所示。式(Ⅴ)。ESI-MS分析(positive)m/z350[M+Na]+；1HNMR(600MHz,DMSO)δ8.09(d,J＝9.0Hz,1H),7.36(d,J＝7.6本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原，其特征在于，其结构式如式(I)所示：       式(I)；其中，n＝0～6。

【技术特征摘要】
1.一种呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原，其特征在于，其结构式如式(I)所示：式(I)；其中，n＝0～6。2.一种呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原，其特征在于，其结构式如式(Ⅱ)所示：式(Ⅱ)；其中，n＝0～6。3.权利要求1所述的呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将氨基甲酸乙酯与式(Ⅲ)所示带羧基的呫吨醇衍生物在室温条件下于含醋酸的甲醇中进行亲核取代反应；(2)蒸干甲醇，用稀盐酸洗涤得到的沉淀，烘干即得半抗原；式(Ⅲ)；其中n＝0～6。4.根据权利要求3所述的呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原的制备方法，其特征在于：步骤(1)所述带羧基的呫吨醇衍生物为9-羟基-9H-呫吨-3-羧酸或2-(9-羟基-9H-呫吨-4-基)乙酸。5.权利要求2所述的呫吨聚氨基甲酸乙酯人工抗原的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)将权利要求1中的呫吨聚氨基甲酸乙酯半抗原与N,N’-二环己基碳二亚胺和...

【专利技术属性】
技术研发人员：徐振林，罗林，孙远明，杨金易，雷红涛，王弘，沈玉栋，刘功良，
申请(专利权)人：华南农业大学，
类型：发明
国别省市：广东;44