膨胀床法分离纯化藻蓝蛋白的方法技术

本发明专利技术公开了一种膨胀床法分离纯化藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：(1)制备藻蓝蛋白粗提液：称取螺旋藻干粉，用反复冻融法进行细胞破壁，提取藻蓝蛋白；(2)吸附剂Streamline DEAE静态吸附藻蓝蛋白；(3)膨胀床吸附分离藻蓝蛋白。在步骤(1)中，以螺旋藻干粉与磷酸钠盐缓冲液的固液比为1:150g/mL，在-20℃和37℃反复冻融5次，每次冻融时间为4h；将冻融5次后的破壁液于5000rpm下离心30min，收集上清液得到藻蓝蛋白的粗提液，置于4℃冰箱中储藏备用。本发明专利技术以螺旋藻为对象，采用膨胀床吸附技术来分离纯化藻蓝蛋白，提高产品的收率和纯度，产率高，缩短操作时间，降低成本，再生性能好，可重复使用，适合规模化生产。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生化分离工程
，特别涉及一种膨胀床法分离纯化藻蓝蛋白的方法。
技术介绍
藻蓝蛋白是一种天然的蛋白资源，应用前景可观。但由于传统藻蓝蛋白分离纯化过程步骤繁琐、耗时多、处理量低的原因，使得分离纯化的成本高，限制了藻蓝蛋白的广泛应用。21世纪以来藻蓝蛋白的作用备受关注，尤其是关于藻蓝蛋白的提取和纯化方面的研究很多，但是在已知的技术中藻蓝蛋白的纯度得率不高。日本DIC是世界上以及有些文献中发表的方法，则完全局限于实验室规模，包括盐析、凝胶过滤，吸附色谱，离子交换色谱，以及其它更昂贵的方法，这些方法大多不适于制备食品色素级的产品。这些方法首先成本高，第二得到的纯度不高。随着藻蓝蛋白荧光试剂的深入研究和进一步的推广使用，要实现藻蓝蛋白在荧光探针等生物化学领域的运用，必需做到提取成本相对降低和纯度达到很高的要求。藻蓝蛋白虽然用途很多，但其受到分离纯化过程的成本高限制，未能得到广泛的应用。传统分离纯化过程是细胞破壁后的藻蓝蛋白溶液经硫酸铵盐沉淀、离心和透析后得到藻蓝蛋白粗提取物，然后选用两种或两种以上的传统色谱方法进一步纯化。其最大的缺点在于分离纯化过程步骤多，导致产率降低、成本增加。膨胀床吸附是近年出现的一种新型生物分离技术，具有集成化优势，可以直接从含有颗粒的料液中捕获目标产物，集料液澄清、目标产物浓缩和分离纯化为一体，从而达到简化操作步骤，提高产品收率，降低生产成本的目的。膨胀床吸附技术现已成功用于各种未澄清粗提液中直接捕获蛋白质等生物制品的领域，如E.coli匀浆、酵母发酵液、哺乳动物细胞培养液、牛奶和动物组织提取物等，也有应用在天然产物小分子物质分离领域中。膨胀床兼有固定床和流化床的优点和集成化的特点，降低了分离纯化的成本，该技术在藻蓝蛋白分离纯化过程中的应用为实现藻蓝蛋白生产的规模化提供了可能。目前，缺乏一种产率高，成本低的膨胀床法分离纯化藻蓝蛋白的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种产率高，成本低的膨胀床法分离纯化藻蓝蛋白的方法。为了实现上述技术问题，本专利技术提供的技术方案为：本专利技术的一种膨胀床法分离纯化藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：(1)制备藻蓝蛋白粗提液：称取螺旋藻干粉，用反复冻融法进行细胞破壁，提取藻蓝蛋白；(2)吸附剂StreamlineDEAE静态吸附藻蓝蛋白；(3)膨胀床吸附分离藻蓝蛋白。进一步地，在步骤(1)中，以螺旋藻干粉与磷酸钠盐缓冲液的固液比为1:150g/mL，在-20℃和37℃反复冻融5次，每次冻融时间为4h；将冻融5次后的破壁液于5000rpm下离心30min，收集上清液得到藻蓝蛋白的粗提液，置于4℃冰箱中储藏备用。进一步地，在步骤(2)中，称取0.15g吸附剂StreamlineDEAE于50mL的具塞三角瓶中，并加入藻蓝蛋白粗提液，在200rpm/min，25℃下进行恒温振荡吸附；吸附1.5小时后取上清液取样一次。更进一步地，在步骤(3)中，将吸附剂StreamlineDEAE装入膨胀柱中，打开出水口，使吸附剂StreamlineDEAE均匀沉降，达到沉降床层高度为H0＝10.0cm时，停止加入吸附剂并关闭出水口，最后使柱中吸附剂表面上留有1cm高度的溶液；用蠕动泵将平衡缓冲液从膨胀床底部入口泵入柱中，吸附剂StreamlineDEAE在柱中不断向上移动，当上升至膨胀床层高度为H为20.0cm不再上升时，将顶部调节器固定在床层上1-2cm处，继续平衡20-30min，使床层稳定；待膨胀床稳定后，将进口流体从平衡缓冲液切换成藻蓝蛋白粗提液，开始进样，整个吸附过程中，控制进样流速，保持膨胀床层的膨胀率稳定；用自动部分收集器每2min收集一次流出液；停止进样后，进口流体从藻蓝蛋白粗提液切换成平衡缓冲液，进行向上冲洗，去除膨胀床中的杂质和弱结合蛋白，制得藻蓝蛋白。进一步地，在步骤(3)中，所述膨胀柱为400mm×16mm。进一步地，在步骤(3)中，所述缓冲液为25mM中性磷酸钠盐缓冲液。有益效果：本专利技术以螺旋藻为对象，采用膨胀床吸附技术来分离纯化藻蓝蛋白，提高产品的收率和纯度，产率高，缩短操作时间，降低成本，再生性能好，可重复使用，适合规模化生产。相对于现有技术，本专利技术具有如下优点：(1)膨胀床吸附技术是一种集料液澄清、目标产物浓缩和分离纯化为一体的新型生物分离技术，可以作为经济、高效、适合规模化生产的纯化方法，在获得高产品纯度和收率的同时也能够保持产品的生物活性。采用该技术代替传统纯化方法可以直接从细胞破壁后的藻蓝蛋白溶液中捕获藻蓝蛋白，大大简化操作步骤。(2)膨胀床法分离纯化藻蓝蛋白，具有集成化优点，减少了传统纯化方法中的离心、蛋白沉淀、透析等步骤，可快速有效的富集分离藻蓝蛋白，藻蓝蛋白的光谱纯度(A620nm/A280nm)可由粗提液的0.23最高提高至2.02，藻蓝蛋白浓度从粗提液的0.17mg/mL提高为2.15mg/mL，膨胀床分离富集藻蓝蛋白的回收率为59.45％。(3)吸附剂颗粒在膨胀床中的膨胀率E(H/H0)随着流体流速的增加而增加。粒径和密度小的吸附剂在膨胀床中的膨胀率高。基于孔体积因素，建立了形成不同膨胀率的大孔树脂膨胀床的流体流速预测模型。膨胀床法代替传统分离纯化方法，省去离心、蛋白沉淀、透析等步骤，减少了步骤，提高产率，降低成本。附图说明图1是藻蓝蛋白粗提液颜色随pH变化图；图2是在不同盐浓度粗提液中藻蓝蛋白的吸附量随时间变化图；图3是离子强度对吸附效率的影响图；图4是pH对藻蓝蛋白吸附的影响图；图5是pH对吸附前后上清液藻蓝蛋白纯度的影响图；图6是固液比对藻蓝蛋白吸附的影响图；图7是固液比对吸附后上清液纯度的影响图；图8是温度对藻蓝蛋白吸附的影响图；图9是藻蓝蛋白膨胀床吸附的穿透曲线图；图10是藻蓝蛋白吸附量随进样体积变化图；图11是冲洗阶段A620nm变化图；图12是藻蓝蛋白洗脱曲线图；图13是洗脱组分的藻蓝蛋白纯度图；图14是洗脱速度对藻蓝蛋白洗脱的影响图。具体实施方式为了阐明本专利技术的技术方案及技术目的，下面结合图及具体实施方式对本专利技术做进一步的介绍。实验材料与仪器螺旋藻干粉，赐百年生物科技有限公司提供；磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠、叠氮化钠、氯化钠、硫酸铵、浓盐酸、柠檬酸、甘氨酸、醋酸、异丙醇、乙醇，试剂均为分析纯(AR)，购自国药集团化学试剂有限公司；膨胀床吸附剂StreamlineDEAE，购自GEhealthcare公司。玻璃层析柱(规格：400mm×16mm，液体分布器为200目丝网)，上海锦华层析设备厂；BT100-2JDG-2(10滚轮)型蠕动泵，河南保定兰格恒流泵有限公司；FA2004电子天平，CH1010超级恒温水浴，上海衡平仪器仪表厂；TDL-60B低速台式离心机，常州诺基仪器有限公司；BSZ型自动部分收集器，上海泸西分析仪器厂有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵，郑州长城科工贸有限公司；S-25型pH计，上海精科雷磁公司；TU-1901型双光束紫外-可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；THZ-82型恒温振荡器，常州国华电器有限公司；DHG-9140型电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。本专利技术的一种膨胀床法分离纯化藻蓝蛋白的方法，包括如下步骤：(1)制备藻蓝蛋本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种膨胀床法分离纯化藻蓝蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)制备藻蓝蛋白粗提液：称取螺旋藻干粉，用反复冻融法进行细胞破壁，提取藻蓝蛋白；(2)吸附剂Streamline DEAE静态吸附藻蓝蛋白；(3)膨胀床吸附分离藻蓝蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种膨胀床法分离纯化藻蓝蛋白的方法，其特征在于包括如下步骤：(1)制备藻蓝蛋白粗提液：称取螺旋藻干粉，用反复冻融法进行细胞破壁，提取藻蓝蛋白；(2)吸附剂StreamlineDEAE静态吸附藻蓝蛋白；(3)膨胀床吸附分离藻蓝蛋白。2.根据权利要求1所述的膨胀床法分离纯化藻蓝蛋白的方法，其特征在于：在步骤(1)中，以螺旋藻干粉与磷酸钠盐缓冲液的固液比为1:150g/mL，在-20℃和37℃反复冻融5次，每次冻融时间为4h；将冻融5次后的破壁液于5000rpm下离心30min，收集上清液得到藻蓝蛋白的粗提液，置于4℃冰箱中储藏备用。3.根据权利要求1所述的膨胀床法分离纯化藻蓝蛋白的方法，其特征在于：在步骤(2)中，称取0.15g吸附剂StreamlineDEAE于50mL的具塞三角瓶中，并加入藻蓝蛋白粗提液，在200rpm/min，25℃下进行恒温振荡吸附；吸附1.5小时后取上清液取样一次。4.根据权利要求1所述的膨胀床法分离纯化藻蓝蛋白的方法，其特征在于：在步骤(3)中，将吸附剂StreamlineDEAE装入膨胀柱中，...

【专利技术属性】
技术研发人员：高志刚，高志峰，宣卫华，高楠，姜冰冰，汪世军，王海宇，
申请(专利权)人：东台市赐百年生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32