一种具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因、编码蛋白及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因、编码蛋白及其应用，所述融合基因由抗草甘膦蛋白编码基因和抗草铵膦蛋白编码基因构成；所述抗草甘膦编码基因为下列之一：CP4、aroA、G7、G10、GOX或GAT；所述抗草丁膦编码基因为bar或pat。本发明专利技术融合蛋白可以赋予植物草甘膦与草铵膦复合抗性；可以用于制备具有草甘膦与草铵膦复合抗性的转基因植物。本发明专利技术提供的具有草甘膦与草铵膦复合抗性的融合蛋白可以应用于单子叶植物和双子叶植物的抗除草剂方面，主要应用于抗除草剂抗虫玉米、水稻、大豆、小麦和油菜。

【技术实现步骤摘要】
(一)
本专利技术涉及一种具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因、编码蛋白，及该融合蛋白的应用。(二)
技术介绍
杂草和病虫害是农业生产中影响产量的最重要的生物因素。如何降低杂草和病虫害的防治成本、提高防治效率、减少防治过程中给环境造成污染是农业科学研究最关键的问题。杂草时伴随着人类的生产活动而产生的，它们的存在是长期适应气候、土壤、作物、耕作制度及社会因素与栽培作物竞争的结果。人类从开始从事农业生产就在防治杂草，但是当时的杂草防治仅仅是一种极为粗放的初级劳动。随着科学的发展，特别是近代生命科学的发展进步，人类可以通过基因工程的方法赋予农作物耐受各种除草剂的特性，通过喷施除草剂就可以很好的防治杂草，把人类从初级劳动中解放出来，极大的提高效率。草甘膦(Glyphosate)是磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)的竞争类似物，通过植物地上绿色茎叶角质层吸收后，随光合作用产物从韧皮部快速传导至整个植株的各个部位，可防除单子叶和双子叶一年生和多年生草本和灌木等40多科的植物。因其本身广谱、内吸传导式、低毒、低残留、可混性强、价格合理、独特的靶标和作用机理等自身优点，自1971年问世以来，在全世界的销售额已多次位居农药品种的首位。随着转基因作物时代的到来，抗除草剂转基因作物也成为一种普遍的种植需求。1996年美国首先开发了抗草甘膦的转基因大豆，近年来抗草甘膦作物的品种和种植面积还在不断迅速增加。草铵膦是德国赫斯特公司创制的有机磷类非传导灭生性除草剂，其有效成分为phosphinothricin(PPT)。谷氨酰胺合成酶是植物的一个重要的解毒酶，其在植物氮代谢过程中起着至关重要的作用，它能够解除由氨基酸降解、硝酸盐还原以及光呼吸等过程中释放出的铵的毒性。谷氨酰胺合成酶(GS)是草铵膦的靶标酶，草铵膦能够对植物GS起到抑制作用，使植物氮代谢出现失调，进而使所必需的氨基酸出现缺乏，增大细胞中氨含量，促使植物出现中毒，致使叶绿素解体，最终造成植物的死亡。草铵膦具有的特点包括低毒、高活性、良好的环境兼容性等。早期，在全世界范围内草铵膦的用量并不大，近来，转基因抗草铵膦作用的种植不断扩大带动了对草铵膦的需求，草铵膦也逐渐成为了一种极为畅销的除草剂。能赋予农作物草甘膦抗性的基因很多，包括突变的对磷酸烯醇式丙酮酸具有高亲和性，而对草甘膦不敏感的EPSPS基因，例如CP4(Padgette,S.R,Kolacz,K.H,Delannay,X,etal.1995,CropScience,35(5):1451-1461)、aroA(ComaiL,SenLC,StalkerDM.1983,Science,221(4608)：370-371)、G7(中国专利：200910098129.X)、G10(中国专利：201110009329.0)；草甘膦解毒基因，包括可以把草甘膦转化为氨甲基磷酸的草甘膦氧化还原酶基因(glyphosateoxidoreductasegene,GOX)(Kishore,G.M.,&Barry,G.F.1995,Glyphosatetolerantplants)和可以把草甘膦转化为N－乙酰草甘膦的草甘膦乙酰转移酶编码基因(glyphosateN-Acetylation,GAT)(CastleLA；SiehlDL；GortonR；PattenPA；ChenYH；BertainS；ChoHJ；DuckN；WongJ；LiuD；LassnerMW.2004,Science,304(5674),1151-4；Castle,L.A.,Hong,C.Y.,Duck,N.B.,Giver,L.J.,Christina,I.,&Jeremy,M.,etal.2004,WO2002036782A3；2002,WO2002036782A2；GreenJM,HazelCB,RaymondFD,etal.2008,PestManagementScience,64(4):332-9.)。草铵膦是另外一种杀草谱广、生产体系成熟、被广泛应用的灭生性除草剂。目前已经被克隆出来的抗草铵膦基因包括bar(ThompsonCJ；MovvaNR；TizardR；CrameriR；DaviesJE；LauwereysM；BottermanJ.1987,EmboJournal,6(9),2519-23；White,J.,Chang,S.Y.P.,Bibb,M.J.,&Bibb,M.J.1990,NucleicAcidsResearch,18(4),1062-1062.)，pat(Wohlleben,W.,Arnold,W.,Broer,I.,Hillemann,D.,Strauch,E.,&Pühler,A.1988,gene70:25-37.Gene,70(1),25-37)。抗草甘膦转基因作物的大量种植和草甘膦的长期、大规模使用，在美国已经发现了至少21种杂草对草甘膦产生了抗性。据报道，美国堪萨斯州的大豆田中的杂草产生了抗草甘膦能力，以往利用草甘膦可以轻易控制的杂草变得不能被杀灭了，农民一筹莫展。尽管目前抗草甘膦的杂草种类比较少，发生的地点比较孤立，但是为了防止更多草甘膦抗性杂草产生，延长草甘膦在防治杂草方面的有效使用寿命，目前迫切需要研发新的抗其它除草剂的农作物，从而可以通过其它除草剂控制草甘膦抗性杂草和杂草对草甘膦的抗性发展。草甘膦和草铵膦是目前使用最为广泛的两种灭生性除草剂之一。并且，草甘膦和草铵膦的杀灭机理不同。如果能够研发一种同时对草甘膦和草铵膦的转基因植物，就可以通过草甘膦和草铵膦的混配或者轮换使用防治杂草，这样不但可以拓宽单一除草剂的杀草谱还可以延缓杂草对单一除草剂抗性的产生。因此，研发出一种能赋予植物草甘膦与草铵膦复合抗性的基因具有巨大的应用价值。(三)
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种基因，这种基因能够赋予植物草甘膦与草铵膦复合抗性，可以用来生产抗除草剂植物。本专利技术采用的技术方案是：本专利技术提供一种具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因，该基因包括编码抗草甘膦蛋白的核苷酸序列和编码抗草铵膦蛋白的核苷酸序列；上述2个核苷酸序列位于同一个开放阅读框内；抗草甘膦蛋白和抗草铵膦蛋白可以为全长或者截断后的活性多肽片段。具体所述融合基因由抗草甘膦蛋白编码基因和抗草铵膦蛋白编码基因构成；所述抗草甘膦编码基因为下列之一：CP4、aroA、G7、G10、GOX或GAT；所述抗草铵膦编码基因为bar或pat。进一步，所述融合基因由抗草甘膦蛋白编码基因GAT和抗草铵膦蛋白编码基因Bar构成，所述融合基因核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。进一步，所述融合基因由抗草甘膦蛋白编码基因CP4和抗草铵膦蛋白编码基因pat构成，所述融合基因核苷酸序列为SEQIDNO.2所示。本专利技术还提供一种所述具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因编码蛋白。当所述抗除草剂基因为bar，所述的抗虫基因为GAT时，融合蛋白氨基酸序列为SEQIDNO.3；当所述抗除草剂基因为pat，所述的抗虫基因为CP4时，融合蛋白氨基酸序列为SEQIDNO.4。本专利技术还提供一种所述具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因编码蛋白在制备抗除草剂转基因作物中的应用，所述作物包括单子叶作物和本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因，其特征在于所述融合基因由抗草甘膦蛋白编码基因和抗草铵膦蛋白编码基因构成；所述抗草甘膦编码基因为下列之一：CP4、aroA、G7、G10、GOX或GAT；所述抗草铵膦编码基因为bar或pat。

【技术特征摘要】
1.一种具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因，其特征在于所述融合基因由抗草甘膦蛋白编码基因和抗草铵膦蛋白编码基因构成；所述抗草甘膦编码基因为下列之一：CP4、aroA、G7、G10、GOX或GAT；所述抗草铵膦编码基因为bar或pat。2.如权利要求1所述具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因，其特征在于所述融合基因由抗草甘膦蛋白编码基因GAT和抗草铵膦蛋白编码基因Bar构成。3.如权利要求2所述具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因，其特征在于所述融合基因核苷酸序列为SEQIDNO.1所示。4.如权利要求1所述具有草甘膦和草铵膦复合抗性的融合基因，其特征在于所述融合基因由抗草甘膦蛋白编码...

【专利技术属性】
技术研发人员：张先文，王东芳，沈志成，
申请(专利权)人：浙江大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33