一种GyV6新型环形病毒VP3蛋白制备方法技术

本发明专利技术涉及一种GyV6新型环形病毒VP3蛋白的制备方法。该方法是以pGEX‑6p‑1质粒以及GyV6病毒VP3基因为模板，PCR分别扩增出含pGEX‑6p‑1线性化载体以及GyV6病毒VP3基因片段，并利用重组酶进行快速重组克隆；阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。本发明专利技术可直接提供VP3蛋白作为GyV6诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体；为开展GyV6血清学流行病学调查及VP3功能研究提供有效免疫学试剂，填补国内外空白。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种GyV6新型环形病毒VP3蛋白的制备方法。此专利技术可直接提供VP3蛋白作为GyV6诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体；为开展GyV6血清学流行病学调查及VP3功能研究提供有效免疫学试剂，填补国内外空白。
技术介绍
鸡传染性贫血病毒(ChickenInfectiousAnemiaVirus，CAV)一直被认为是圆环病毒科(Circoviridae)中环形病毒属(Gyrovirus)唯一成员。直到2011年，Rijsewijk等从发病鸡的血清样品中检测到新型环形病毒序列，即环形病毒属中第二个成员，命名为AGV2。同年，Sauvage等在健康人的皮肤棉试样品中检测到首个与AGV2高度同源的人源环形病毒HGyV序列。自2012年，其它新型环形病毒包括GyV3，GyV4，GyV5，GyV6，GyV7，GyV8及GyV9被陆续发现鉴定，并具有潜在的公共卫生意义。然目前尚无检测GyV6抗原及其抗体的血清学方法。因此，对GyV6病毒早期表达蛋白VP3基因在体外进行克隆，构建VP3表达载体，实现其表达，将为深入开展GyV6蛋白抗原及其抗体检测、血清学调查，明确GyV6在鸡群以及人群中的感染复制情况提供有效诊断试剂；并为探究GyV6VP3生物学功能具有重要意义。在传统表达载体的构建中，往往需要设计选择限制性内切酶酶切位点，通过酶切、连接的方法构建载体，实现外源基因的表达。但有时由于找不到合适的酶切位点，往往导致克隆过程繁琐，效率低下。本专利技术中将利用不依赖于酶切位点及限制性内切酶的重组酶ExnaseTMII体外重组技术克隆GyV6病毒VP3基因，简化克隆过程，实现VP3基因快速克隆表达。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种GyV6新型环形病毒VP3蛋白，实现VP3蛋白的表达。本专利技术的原理和最核心的关键技术是科学地设计扩增出pGEX-6p-1线性化载体以及GyV6病毒VP3基因片段的引物，利用商品化的重组酶ExnaseTMII不经酶切连接反应，直接在体外快速重组克隆VP3，转化大肠杆菌，经IPTG诱导表达、实现GyV6的VP3蛋白与GST的融合表达，并获得纯化的VP3融合蛋白。本专利技术所述的GyV6新型环形病毒VP3蛋白的制备方法，以pGEX-6p-1质粒以及GyV6病毒VP3基因为模板，PCR分别扩增出含pGEX-6p-1线性化载体以及GyV6病毒VP3基因片段(附图1，步骤1)，并利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆(附图1，步骤2)；阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达(附图1，步骤3)。上述方法包括以下步骤：1)利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；上游引物：5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC3’(SEQIDNO.1)；；下游引物：5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT3’’(SEQIDNO.2)；2)利用下述引物，以GyV6-VP3基因为模板，PCR扩增出VP3基因；上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGTCAGAAAACACATC3’(SEQIDNO.3)；下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGGCCTC3’(SEQIDNO.4)；3)利用重组酶ExnaseTMII对步骤1)和2)得到的PCR产物进行快速重组克隆；阳性克隆经IPTG诱导后进行表达鉴定与纯化。本专利技术公开了PCR扩增pGEX-6p-1线性化载体引物以及PCR扩增GyV6病毒VP3基因引物序列。本专利技术还公开了一种基于重组酶ExnaseTMII将线性化的pGEX-6p-1线性化载体与GyV6病毒VP3基因片段PCR产物不经酶切连接反应，直接重组克隆技术；并转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。本专利技术设计的引物及基于重组酶ExnaseTMII的克隆策略，可快速构建GyV6病毒VP3基因的原核表达载体。本专利技术获得的GyV6病毒VP3表达及纯化的蛋白，可直接提供VP3蛋白作为GyV6诊断抗原；作为免疫原获得抗VP3多克隆抗体；为开展GyV6流行病学调查提供有效诊断试剂；并为进一步探究VP3生物学功能具有重要意义。附图说明图1一种GyV6新型环形病毒VP3蛋白制备方法策略示意图步骤1：以人工合成的GyV6病毒VP3基因为模板，利用表1中引物，PCR分别扩增出含pGEX-6p-1线性化载体以及GyV6病毒VP3基因片段。步骤2：利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆。步骤3：阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。图2PCR扩增GyV6病毒VP3片段泳道1，GyV6病毒VP3片段PCR产物；泳道M，DNAMarker。图3PCR扩增线性化载体pGEX-6p-1泳道1，线性化载体pGEX-6p-1的PCR产物；泳道M，DNAMarker。图4SDS-PAGE分析GyV6病毒VP3基因的表达泳道M，蛋白Marker；泳道1为GST-VP3上清；泳道2为GST-VP3沉淀；泳道3为pGEX6P-1空载体上清；泳道4为pGEX6P-1空载体沉淀；5为GST-VP3纯化后产物。图5Westernblot鉴定抗AGV3VP3蛋白多克隆抗体1,转染EGFP-VP3表达质粒的293T细胞裂解物；2，为转染对照EGFP表达质粒的293T细胞裂解物。具体实施方式为更好的理解本专利技术的内容，以下实施方式结合附图给出了GyV6新型环形病毒VP3蛋白制备的示例。实施例1)设计扩增含pGEX-6p-1线性化载体以及GyV6病毒VP3基因片段引物：扩增pGEX-6p-1线性化载体上游引物位于pGEX-6p-1质粒1022-1047位；且在5’端带有额外TAA碱基；扩增pGEX-6p-1线性化载体下游引物位于pGEX-6p-1质粒916-941位；且在5’端带有额外CAT碱基。扩增GyV6病毒VP3基因上游引物包括VP3基因起始密码ATG及其后14个碱基，且在5’端带有16个与pGEX-6p-1线性化载体下游引物反向互补碱基；扩增GyV6病毒VP3基因下游引物包括VP3基因终止密码TAA及其前14个碱基，且在5’端带有16个与pGEX-6p-1线性化载体上游引物反向互补碱基。具体引物序列如下，由LifeTechnologies上海赛默飞世尔科技公司合成。pGEX-6p-1线性化表达载体引物：上游引物：5‘TAATGACGGTGAAAACCTCTGACACATGC3’(SEQIDNO.1)；下游引物：5‘CATGGGCCCCTGGAACAGAACTTCCAGAT3’’(SEQIDNO.2)；GyV6-VP3基因引物：上游引物：5‘GTTCCAGGGGCCCATGTCAGAAAACACATC3’(SEQIDNO.3)；下游引物：5‘GTTTTCACCGTCATTACAGTCTTAGGCCTC3’(SEQIDNO.4)。2)pGEX-6p-1线性化载体以及GyV6病毒VP3基因片段PCR扩增：以pGEX-6p-1质粒以及合成的GyV6VP3基因(GenBank:KF294862.1)为模版，表1所述引物为引物进行PCR扩增。如图1中的步骤1。PCR扩增反应体系为：40μl水，5μl10倍缓冲液，1μl10mM本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种GyV6新型环形病毒VP3蛋白的制备方法，其特征在于，以pGEX‑6p‑1质粒以及GyV6病毒VP3基因为模板，PCR分别扩增出含pGEX‑6p‑1线性化载体以及GyV6病毒VP3基因片段，并利用重组酶ExnaseTM II进行快速重组克隆；阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。

【技术特征摘要】
1.一种GyV6新型环形病毒VP3蛋白的制备方法，其特征在于，以pGEX-6p-1质粒以及GyV6病毒VP3基因为模板，PCR分别扩增出含pGEX-6p-1线性化载体以及GyV6病毒VP3基因片段，并利用重组酶ExnaseTMII进行快速重组克隆；阳性克隆转化到大肠杆菌，实现VP3蛋白表达。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于包括以下步骤：1)利用下述引物，以pGEX-6p-1质粒为模板，PCR扩增出pGEX-6p-1线性化表达载体；上游引物：5‘TAATGACGGTG...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶建强，郑文铝，邵红霞，秦爱建，田晓彦，万志敏，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32