本发明专利技术提供一种脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒及其应用。本发明专利技术的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，包括：引物SMN‑Ex7‑F，其序列如SEQ ID NO.1；引物SMN‑Ex7‑R，其序列如SEQ ID NO.2；探针SMN‑Ex7‑P，其序列如SEQ ID NO.3。本发明专利技术的上述试剂盒可用于脊髓性肌萎缩症致病基因携带者的检测，检测方法包括如下步骤：提取待检测者的基因组DNA；对待检测者基因组DNA进行准确定量；以待检测者基因组DNA为模板进行第一荧光定量PCR，得到第一荧光定量曲线。本发明专利技术的试剂盒能够直观、准确、快速、简便地对SMN1基因进行检测，从而实现SMA致病基因携带者与正常人的区分。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种检测试剂盒，具体涉及一种脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒及其应用。
技术介绍
脊髓性肌萎缩(SMA)是一种常染色体隐性遗传疾病，其是由基因突变导致脊髓前角细胞变性引起的神经肌肉遗传病，临床表现为进行性、对称性肢体近端和躯干肌肉无力、萎缩，患者最终死于呼吸衰竭和严重的肺部感染。SMA是发病率第二高的致死性常染色体隐性遗传病，目前尚无有效的治疗方法。SMA在活产婴儿中发病率约为1/6000～1/10000，人群中的携带率为1/35～1/80。鉴于SMA在中国人群中具有较高的携带率和发病率，通过SMA携带者筛查进行婚姻与生育指导，是阻断该病遗传最为有效的方式。SMA致病基因为运动神经元存存活基因(SMN)。SMN基因在全身组织中普遍表达，大部分细胞可以耐受低水平的SMN蛋白，但脊髓前角细胞(脊髓运动神经元)无法耐受低水平的SMN蛋白，结果神经元逐步死亡而患者肌肉日渐萎缩。SMN基因定位于5q13区，具有两个高度同源的拷贝：SMN1和SMN2。SMN1基因表达完整而稳定的SMN功能蛋白，是SMA的决定性基因，SMN1基因缺陷造成SMA表型；SMN2基是SMA的补偿基因，只能表达少量有生物活性的SMN蛋白，SMN2基因缺失不造成SMA表型，但是SMN2拷贝数与SMA表型的轻重直接相关。已有统计表明，约95％的SMA患者为SMN1基因缺失型(第7和/或第8外显子纯合缺失)。因此，基于人群的SMA致病基因携带者筛查，主要是针对SMN1基因缺失的检测。根据SMA致病基因的特点，目前的诊断策略是分析SMN1基因第7外显子是否存在缺失及缺失数目。现有的SMN基因诊断技术包括：聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)技术、等位基因特异性扩增技术、多重连接探针扩增(MLPA)、高分辨溶解曲线(HRM)、变性高效液相色谱(DHPLC)和荧光实时定量PCR。PCR-RFLP、等位基因特异性扩增和HRM技术仅适合于检测SMN1基因的纯合缺失，然而不能区分杂合缺失的SMA致病基因携带者与不存在缺失的正常人。MLPA技术是目前SMA实验室诊断的主流技术，该方法采用荷兰MRC公司的SMAMLPA检测试剂盒，其成本昂贵(>150元/样本)，并且需要毛细管电泳等贵重分析仪器，耗时长，不适合用于大规模人群的筛查工作。鉴于我国提出预防出生缺陷和减少先天残疾患儿出生等提高出生人口素质的目标，因此研发准确可靠、简单实用、标准化的SMN1基因检测方法，对于开展SMA疾病诊断、SMA致病基因携带者筛查、分子群体流行病学调查等相关工作具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒及其应用，该试剂盒能够直观、准确、快速、简便地对SMN1基因的拷贝数进行检测，从而能够实现SMA致病基因携带者与正常人的区分。本专利技术提供一种脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，包括：引物SMN-Ex7-F，其序列如SEQIDNO.1；引物SMN-Ex7-R，其序列如SEQIDNO.2；探针SMN-Ex7-P，其序列如SEQIDNO.3。本专利技术的试剂盒针对性地对SMA致病基因SMN1基因的Exon7关键位点进行检测，从而反映SMN1基因的拷贝数；其中，引物SMN-Ex7-F和引物SMN-Ex7-R特异性扩增SMN1和SMN2基因的Exon7，而探针SMN-Ex7-P特异性针对SMN1Exon7c.840位点，该PCR引物对和Taqman探针能够针对性地对SMN1基因进行检测，而不受SMN2基因的干扰。进一步地，本专利技术的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，还可以包括：引物SMN-In7-F，其序列如SEQIDNO.4；引物SMN-In7-R，其序列如SEQIDNO.5；探针SMN-In7-P，其序列如SEQIDNO.6。上述试剂盒还能够针对性地对SMA致病基因SMN1基因的Intron7关键位点进行检测，进一步反映SMN1基因的拷贝数；其中，引物SMN-In7-F和引物SMN-In7-R特异性扩增SMN1和SMN2基因的Intron7，而探针SMN-In7-P特异性针对SMN1Intron7IVS7+87位点，该PCR引物对和Taqman探针能够针对性地对SMN1基因进行检测，而不受SMN2基因的干扰。进一步地，本专利技术的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，还可以包括：引物RPP30-Ex1-F，其序列如SEQIDNO.7；引物RPP30-Ex1-R，其序列如SEQIDNO.8；探针RPP30-Ex1-P，其序列如SEQIDNO.9。上述试剂盒还设置用于检测内参基因RPP30的引物对和探针，有利于提高检测的准确性；其中，引物RPP30-Ex1-F和引物RPP30-Ex1-R特异性扩增内参基因RPP30Exon1，而探针RPP30-Ex1-P特异性检测RPP30基因。本专利技术对上述各引物和探针的设置浓度不作严格限制，只要其浓度范围不影响SMA致病基因的正常检测即可，可以为本领域的常规浓度范围，例如10-20μM。进一步地，本专利技术的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒还可以包括对照DNA标本，例如SMA患者、SMA携带者、正常人等的对照DNA标本，其可在对待检测者进行SMA致病基因检测时作为对照，从而便于根据检测结果对待检测者的类型进行判定。在本专利技术的具体方案中，脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒还包括：非脊髓性肌萎缩症正常基因型对照组gDNA标本、脊髓性肌萎缩症携带者基因型对照组gDNA标本和脊髓性肌萎缩症患者基因型对照组gDNA标本中的至少一种；特别是，本专利技术的试剂盒同时包括上述三种标本，从而能够对待检测者的类型进行精确地判定。具体地，非脊髓性肌萎缩症正常基因型对照组gDNA标本中SMN1基因Exon7和Exon8、SMN2基因Exon7和Exon8的拷贝数均为2；脊髓性肌萎缩症携带者基因型对照组gDNA标本中SMN1基因Exon7和Exon8的拷贝数均为1，SMN2基因Exon7和Exon8的拷贝数均为2；而脊髓性肌萎缩症患者基因型对照组gDNA标本中SMN1基因Exon7和Exon8的拷贝数均为0，SMN2基因Exon7和Exon8的拷贝数均为2。对上述各对照组gDNA标本的浓度不作严格限制，只要其浓度范围不影响SMA致病基因的正常检测即可，可以为本领域的常规浓度范围，例如10-200ng/μL。进一步地，本专利技术的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒还可以包括其它必要的试剂，例如用于荧光定量PCR的相关试剂；具体可以为2×TaqPCRMastermix，其可以包括TaqDNA聚合酶、dNTPs、MgCl2、反应缓冲液、PCR反应增强剂、优化剂、稳定剂等本领域常规试剂，可根据本领域常规方式进行自行配制或通过普通市售获得。本专利技术还提供上述任一所述的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒在脊髓性肌萎缩症致病基因检测试上的应用；特别是在脊髓性肌萎缩症致病基因携带者检测上的应用。具体地，可以采用上述任一所述的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒以待检测者基因组DNA为模板进行荧光定量PCR。本专利技术还提供一种脊髓性肌萎缩症致病基因携带者检测方法，包括如下步骤：提取待检测者的基因组DNA；对待检测者基因组DNA进行准确定量；以待本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，其特征在于，包括：引物SMN‑Ex7‑F，其序列如SEQ ID NO.1；引物SMN‑Ex7‑R，其序列如SEQ ID NO.2；探针SMN‑Ex7‑P，其序列如SEQ ID NO.3。
【技术特征摘要】
1.一种脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，其特征在于，包括：引物SMN-Ex7-F，其序列如SEQIDNO.1；引物SMN-Ex7-R，其序列如SEQIDNO.2；探针SMN-Ex7-P，其序列如SEQIDNO.3。2.根据权利要求1所述的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，其特征在于，还包括：引物SMN-In7-F，其序列如SEQIDNO.4；引物SMN-In7-R，其序列如SEQIDNO.5；探针SMN-In7-P，其序列如SEQIDNO.6。3.根据权利要求1或2所述的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，其特征在于，还包括：引物RPP30-Ex1-F，其序列如SEQIDNO.7；引物RPP30-Ex1-R,其序列如SEQIDNO.8；探针RPP30-Ex1-P，其序列如SEQIDNO.9。4.根据权利要求1至3任一所述的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒，其特征在于，还包括：非脊髓性肌萎缩症正常基因型对照组gDNA标本、脊髓性肌萎缩症携带者基因型对照组gDNA标本和脊髓性肌萎缩症患者基因型对照组gDNA标本中的至少一种。5.权利要求1至4任一所述的脊髓性肌萎缩症致病基因检测试剂盒在脊髓性肌萎缩症致病基因检测试上的应用。6.一种脊髓性肌萎缩症致病基因携带者检测方法，其特征在于，包括如下步骤：提取待检测者的基因组DNA；对待检测者基因组DNA进行准确定量；以待检测者基因组DNA为模板进行第一荧光定量PCR，得到第一荧光定量曲线；其中，第一荧光定量PCR体系包括：引物SMN-Ex7-F，其序列如SEQIDNO.1；引物SMN-Ex7-R，其序列如SEQIDNO.2；探针SMN...
【专利技术属性】
技术研发人员：梅世月，白楠，赵振华，孔祥东，
申请(专利权)人：郑州大学第一附属医院，
类型：发明
国别省市：河南;41
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