筛选基因编辑产物的方法技术

本发明专利技术公开了一种ACT‑PCR筛选基因编辑产物的方法，包括如下步骤：1)、提取野生型及待测样品的基因组DNA；2)、设计引物：使正向引物FA的3’末端跨过基因编辑拟切割位点；反向引物RA是以目标基因的基因组序列为参照，位于互补链的下游，反向引物RA的Tm值不低于正向引物FA；3)、获得最大临界退火温度Tam和最小临界退火温度Tlm；4)、利用引物对FA/RA以基因组DNA为模板、设定退火温为Tlm<Tm≤Tam之间，进行PCR扩增；5)、将扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；能够扩增出目的条带所对应的样品为野生型或者杂合突变体；不能扩增出目的条带所对应的样品为纯合突变体。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一种利用ACT-PCR筛选基因编辑产物的方法与应用。
技术介绍
近年来，利用ZFN、TALEN、CRISPR-Cas9、Cpf1、Ago等基因编辑系统，在多个物种中成功实现了基因组的定点编辑。这些系统可对基因组中特定的DNA序列进行精细改造，在特定位置敲除或者插入基因。利用这些系统进行基因组编辑会产生大量的突变体，因此鉴定这些突变体的工作量巨大。而目前对基因编辑突变体的筛选主要有以下几种方法：PCR酶切(PCR/RE)检测法，T7EI酶切法，高分辨率溶解曲线分析法等。这些方法在实际应用中存在一定缺陷：PCR/RE检测法只适用于编辑位点处存在限制性内切酶切点的靶序列，这个条件限制了靶序列的选择；T7EI酶切法适合鉴定杂合突变体，但对纯合突变体的鉴定相对繁琐，不利于实际应用；利用高分辨率溶解曲线分析法需要昂贵的仪器。这些鉴定方法限制了大规模高通量地筛选基因编辑后产生的突变体。与此同时，目前鉴定通过基因编辑的方法得到的混合细胞系主要用的PCR/RE和T7EI酶切法，并不能精确定量细胞系中的突变效率。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种ACT-PCR筛选基因编辑产物(突变体)的方法，采用本专利技术的方法能简单、快捷、廉价、高通量地鉴定基因编辑产物(突变体)。在此基础上结合实时荧光定量PCR技术，还可以精确定量细胞系中的突变效率。本专利技术利用PCR反应程序中，退火温度决定引物与模板结合效率的特点，根据野生型序列，在突变位点附近设计特异正向引物及退火温度略高于正向引物的反向引物，在严格的退火温度范围内，通过常规PCR反应来鉴定基因编辑突变体。其中，由于特异的正向引物与突变体模板不能完全匹配，在严格的退火温度下不能进行有效扩增，因此不能扩增得到PCR产物的样品即为突变序列。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种ACT-PCR筛选基因编辑产物的方法，包括如下步骤：1)、提取野生型及待测样品的基因组DNA，以获得PCR模板；备注说明：待测样品是以野生型为背景材料，基因编辑后得到的待鉴定材料；2)、引物设计：以目标基因的基因组序列为参照，设计ACT-PCR正向引物FA，使正向引物FA的3’末端跨过基因编辑拟切割位点；反向引物RA是以目标基因的基因组序列为参照，位于互补链的下游(位于正向引物下游)，设计反向引物RA的Tm值不低于正向引物FA；设计策略如图1所示。3)、利用步骤2)的引物对FA/RA以野生型基因组DNA为模板进行退火温度梯度PCR扩增；将所得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；能够扩增出目的条带所对应的最高温度为临界退火温度Tam；模型如图2所示，其中第8点样孔所对应的Tm即为临界退火温度Tam，作为后续的ACT-PCR退火温度。利用步骤2)的引物对FA/RA以已知突变体基因组DNA为模板进行退火温度梯度PCR扩增；将所得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；能够扩增出目的条带所对应的最高温度为最小临界退火温度Tlm；模型如图3所示，其中第4点样孔所对应的Tm即为最小临界退火温度Tlm，后续的ACT-PCR退火温度必须大于此温度。4)、利用步骤2)的引物对FA/RA以步骤1)所提取的基因组DNA为模板、设定退火温为Tlm<Tm≤Tam之间，建议选择Tam，进行PCR扩增(为普通PCR扩增)；5)、将步骤4)所得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；结果如图4所示。其中能够扩增出目的条带所对应的样品为野生型(基因型为AA)或者杂合突变体(基因型为Aa)，不能扩增出目的条带所对应的样品为纯合突变体(基因型为aa)，如示意图4所示，其中#3，#5，#6，#8，#10所对应的样品即为突变体。6)、结合实时荧光定量PCR检测细胞系中基因编辑效率；提取未编辑(对照)及经编辑的细胞系DNA为模板，设定退火温度为Tam，进行实时荧光定量PCR检测；设定CtA1为未编辑细胞系样本目标基因Ct值，CtB1为它的内参基因Ct值；设定CtA2为经编辑细胞系样本目标基因Ct值，CtB2为它的内参基因Ct值，根据公式计算得到ΔΔCt＝(CtA2–CtB2)-(CtA1–CtB1)，则经编辑细胞系中目标基因的检测水平是未经编辑细胞系的2-ΔΔCt倍，即在经编辑细胞系中，有(1-2-ΔΔCt)×100％的目标基因发生了编辑。作为本专利技术的ACT-PCR筛选基因编辑产物的方法的改进：所述步骤2)中：正向引物FA的3’末端跨过基因编辑拟切割位点为1～6bp(较佳为2～6bp)。作为本专利技术的ACT-PCR筛选基因编辑产物的方法的进一步改进：所述步骤2)中：正向引物FA的引物序列为N1-20，长度为20bp；对于目标基因正向引物对应的基因组序列为N1NNNNNNNNNNNNNNN↓NNNN20，↓表示基因编辑拟切割突变位点，所对应的正向引物FA为N1-20。作为本专利技术的ACT-PCR筛选基因编辑产物的方法的进一步改进：所述步骤2)中：正向引物FA：N1NNNNNNNNNNNNNNNNNNN20。作为本专利技术的ACT-PCR筛选基因编辑产物的方法的进一步改进：所述步骤4)中：PCR扩增体系和程序如下：反应程序：94℃，变性2分钟；然后94℃变性30秒，Tam退火30秒，72℃延伸30秒，扩增33个循环；最后在72℃下延伸2分钟。综上所述，本专利技术提供一种新的PCR技术，即ACT-PCR，提供了ACT-PCR引物设计原则和退火温度设定方法，并提供了利用ACT-PCR筛选基因编辑突变体及计算细胞系突变效率的方法。本专利技术提供了利用ACT-PCR筛选基因编辑突变体的应用。在本专利技术PCR引物设计时，需要跨过拟切割突变位点。ACT-PCR扩增的退火温度是通过温度梯度PCR确定的，是以野生型DNA为模板，温度梯度PCR中能扩增出条带的最高温度为退火温度，但不限于仅此温度，包括所有可以区分野生型和突变体的退火温度。本专利技术具有如下优点：1、不受靶序列没有酶切位点的限制。2、无须对PCR产物进行特殊处理。3、不依赖于特殊的检测仪器。4、只需通过简单的PCR和琼脂糖凝胶电泳过程，即可完成对基因编辑突变体的大量筛选，极大简化了筛选过程，节约了筛选成本。5、结合实时荧光定量PCR技术，还可以精确定量细胞系中的突变效率。附图说明下面结合附图对本专利技术的具体实施方式作进一步详细说明。图1为ACT-PCR引物设计示意图。图2为临界退火温度Tam示意图；M代表DNAmaker，1～12代表以野生型DNA为模板，以FA/RA为引物，温度梯度PCR扩增出来的12个DNA产物琼脂糖凝胶电泳的结果示意图，用于确定临界退火温度Tam。图3为最小临界退火温度Tlm示意图；M代表DNAmaker，1～12代表以突变体DNA为模板，以FA/RA为引物，温度梯度PCR扩增出来的12个DNA产物琼脂糖凝胶电泳的结果示意图，用于确定临界退火温度Tlm。图4为ACT-PCR产物琼脂糖凝胶电泳示意图；M代表DNAmaker，1～12代表以转基因系的不同个体的DNA为模板，以FA/RA为引物，Tam为退火温度，扩增产物琼脂糖凝胶电泳的结果示意图。图5为OsPDS突变位点临界退火温度Tam琼脂糖凝胶电泳图；M代表DNAmaker(DL2000)，1本文档来自技高网...

【技术保护点】
ACT‑PCR筛选基因编辑产物的方法，其特征是包括如下步骤：1)、提取野生型及待测样品的基因组DNA，以获得PCR模板；2)、设计引物：以目标基因的基因组序列为参照，设计ACT‑PCR正向引物FA，使正向引物FA的3’末端跨过基因编辑拟切割位点；反向引物RA是以目标基因的基因组序列为参照，位于互补链的下游，反向引物RA的Tm值不低于正向引物FA；3)、利用步骤2)的引物对FA/RA以野生型基因组DNA为模板进行温度梯度PCR扩增；将所得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；能够扩增出目的条带所对应的最高温度为最大临界退火温度Tam；利用步骤2)的引物对FA/RA以已知突变体基因组DNA为模板进行退火温度梯度PCR扩增；将所得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；能够扩增出目的条带所对应的最高温度为最小临界退火温度Tlm；4)、利用步骤2)的引物对FA/RA以步骤1)所提取的基因组DNA为模板、设定退火温为Tlm<Tm≤Tam之间，进行PCR扩增；5)、将步骤4)所得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；能够扩增出目的条带所对应的样品为野生型或者杂合突变体；不能扩增出目的条带所对应的样品为纯合突变体。...

【技术特征摘要】
1.ACT-PCR筛选基因编辑产物的方法，其特征是包括如下步骤：1)、提取野生型及待测样品的基因组DNA，以获得PCR模板；2)、设计引物：以目标基因的基因组序列为参照，设计ACT-PCR正向引物FA，使正向引物FA的3’末端跨过基因编辑拟切割位点；反向引物RA是以目标基因的基因组序列为参照，位于互补链的下游，反向引物RA的Tm值不低于正向引物FA；3)、利用步骤2)的引物对FA/RA以野生型基因组DNA为模板进行温度梯度PCR扩增；将所得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；能够扩增出目的条带所对应的最高温度为最大临界退火温度Tam；利用步骤2)的引物对FA/RA以已知突变体基因组DNA为模板进行退火温度梯度PCR扩增；将所得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；能够扩增出目的条带所对应的最高温度为最小临界退火温度Tlm；4)、利用步骤2)的引物对FA/RA以步骤1)所提取的基因组DNA为模板、设定退火温为Tlm<Tm≤Tam之间，进行PCR扩增；5)、将步骤4)所得的扩增产物通过琼脂糖凝胶电泳进行分离；能够扩增出目的条带所对应的样品为野生型或者杂合突变体；不能扩增出目的条带所对应的样品为纯合突变体。2.根据权利要求1所述的ACT-PCR筛选基因编辑产物的方法，其特征是：该方法还包括如下的步骤6)：6)、结合实时荧光定量PCR检测细胞系中基因编辑效率；提取未编辑及经编辑的细胞系DNA为模板，设定退火温度为Ta...

【专利技术属性】
技术研发人员：王克剑，华宇峰，王春，
申请(专利权)人：中国水稻研究所，
类型：发明
国别省市：浙江;33