本发明专利技术公开了基于PGM快速检测牛乳或鸡组织中抗生素残留的方法。本发明专利技术是对待测牛乳或鸡组织进行灭菌后添加葡萄糖和S.thermophilus，培养后，用PGM测定培养物中葡萄糖浓度值，计算S.thermophilus对葡萄糖发酵的抑制率。本标准确定以抑制率是否大于或等于50%作为有无抗生素残留的判断依据。本标准对牛乳中存在的青霉素、链霉素、庆大霉素和卡那霉素的检测限分别为4 μg/L、50 μg/L、100 μg/L、50 μg/L；对鸡组织中青霉素和庆大霉素的检测限分别为12.5 μg/kg和50 μg/kg，都低于对应国标限定的最低残留量。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于食品中抗生素残留快速检测
，具体涉及一种基于电流型便携式葡萄糖传感器(PGM)及其配套电极结合S.thermophilus对葡萄糖发酵抑制率的测定和计算，实现以客观判定为依据对牛乳或鸡组织中抗生素残留的快速检测。
技术介绍
抗生素具有良好的抗感染效果，价格便宜，容易获得等优点，在畜牧业和水产业得到了广泛应用，但也因此造成了严重的抗生素残留问题。长期使用抗生素或者食用抗生素残留的食品都会造成人及其动物体内抗生素累积，危害人体健康，如发生过敏反应、微生态平衡破坏致免疫系统受损以及体内产生一定的耐药性致病菌株；如长期食用的食品中含有氨基糖苷类抗生素残留则会引起中耳炎和肾毒性疾病；而如果人体内的抗生素残留量达到一定程度时还可能会导致人体癌症和基因突变。近年来，由于经济利益的驱使，现在抗生素在畜、禽和水产养殖业生产中的滥用越来越多，已经成为我国和全世界都面临的严重问题。长期食用含有抗生素残留的食品，可能会导致人体产生过敏反应和耐药性等，如氯霉素，会导致再生障碍性贫血和粒细胞缺乏症，从而危害人类的健康。目前抗生素残留的检测方法主要有微生物抑制法、理化分析法和免疫检测法，其中微生物抑制法的TTC法，我国食品卫生标准中规定的检查牛乳中抗生素残留的检测方法(GB5409-85)。该法简单、快速，检测成本低，3～4h可以出结果，适用于基层检测单位采用，但是需要通过肉眼主观来判断显色状态，没有客观判定标准，易产生一定的误差，并且对微红色难以做出准确的判断；理化分析方法虽然具有较高的准确性和灵敏性，但是样品前处理和检测过程都较复杂，仪器设备昂贵。因此，研制简便、快速、经济和准确的抗生素残留的检测方法具有重要的现实意义。电流型便携式葡萄糖传感器(简称便携式血糖仪，Personalglucosemeters，PGM)具有体积微小、便携、经济、操作简便、快速准确等突出优点，己被广泛应用于糖尿病患者血糖的医院随时检测和自我监测。将具有如此突出优点和成熟的检测技术引入到繁琐的食品致病菌和抗生素残留的快速检测领域，具有很好的创新性、研究价值和应用前景。目前仅有的基于PGM构建的对非糖类物质检测的方法所必须用到的蔗糖转化酶标记抗体或核酸类物质等生物制剂的制备较繁琐，活性等易受贮存时间和贮存环境等条件作用而降低，不但影响检测结果的准确性，同时，在简便、快捷和经济方面的优势也受到了很大影响。本专利技术将微生物检测法易于普及的特点与PGM简便灵敏的优势相结合，采用S.thermophilus作为指示菌，利用PGM测定S.thermophilus发酵体系中的葡萄糖浓度，若样品中有抗生素残留，S.thermophilus生长繁殖受到抑制，消耗葡萄糖的能力也就受到抑制。基于此原理，以牛乳中青霉素、氯霉素、庆大霉素和卡那霉素残留以及鸡组织中青霉素和庆大霉素残留为检测对象，对一系列试验结果进行综合分析和对比，以提高此方法的灵敏度与稳定性，为抗生素残留的检测提供了一种简便、快速、经济、准确的新方法。
技术实现思路
为了克服现有技术中的上述缺陷，本专利技术提供了一种基于PGM快速检测牛乳或鸡组织中抗生素残留的方法。基于PGM快速检测牛乳或鸡组织中抗生素残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种的培养和收集：将嗜热链球菌(S.thermophilus)菌株划斜面置于37℃培养12h后，挑取一环S.thermophilus菌种，接种到灭菌脱脂乳中，置于37±1℃下培养15h进行活化；取活化后的菌液置于MRS培养基中进行扩大培养15h，用生理盐水洗下菌体，最后用生理盐水悬浮菌体计数1×108cfu/mL后备用，得菌液；(2)取牛乳或匀浆后的鸡组织样本5.0g，加入葡萄糖使葡萄糖浓度为10～15.0mmol/L，再加入步骤(1)的菌液1mL；对照组为无抗牛乳或匀浆后的无抗鸡组织5.0g，加入葡萄糖使其浓度与样本相同，再加入步骤(1)的菌液1mL；空白组为无抗牛乳或匀浆后的无抗鸡组织5.0g，加入葡萄糖使其浓度与样本相同，不加菌液；80℃灭菌20min，在对应时间0min、180min取出，用电流型便携式葡萄糖传感器(PGM)测定样本、对照组和空白组中葡萄糖含量，计算葡萄糖浓度的变化(ΔC)，ΔC＝C1－C2，C1为0h时的葡萄糖浓度，C2为180min时的葡萄糖浓度；(3)计算葡萄糖发酵抑制率：葡萄糖发酵抑制率＝[(对照ΔC-样品ΔC-空白ΔC)/对照ΔC]×100％；(4)葡萄糖发酵抑制率等于或大于50％的，即可判定被测牛乳或鸡组织中抗生素残留为阳性。进一步地，步骤(2)中，当样本为牛乳时，加入葡萄糖使葡萄糖浓度为10mmol/L。当样本为鸡组织时，加入葡萄糖使葡萄糖浓度为15mmol/L。抗生素残留是食品中重要危害因素，特别是在我国，为构建更敏感准确的残留抗生素快速检测新方法，本专利技术根据抗生素能抑制嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus，S.thermophilus)发酵且PGM能快速检测一定基质中葡萄糖发酵抑制率的原理，创建了一种牛乳和鸡组织中抗生素残留的快速检测方法。在无抗乳中添加适量葡萄糖，利用S.thermophilus在发酵过程中能分解葡萄糖和在抗生素存在的情况下生长受到抑制的原理，用PGM测定发酵过程中的葡萄糖浓度。对牛乳中葡萄糖初始浓度、S.thermophilus添加量、检测时间等因素的选择和优化，结果确定乳中抗生素检测的最佳条件为葡萄糖初始浓度为15.0mmol/L，S.thermophilus的添加量为1×108cfu/mL，检测时间为3h，牛乳中青霉素、链霉素、庆大霉素和卡那霉素的检测限分别为4μg/L、50μg/L、100μg/L、50μg/L，鸡组织中青霉素和庆大霉素的检测限分别为12.5μg/kg、50μg/kg。此方法具有简便快速、检测成本低廉、容易实施等优点，适用于基层检测机构的抗生素残留检测。附图说明图1是PGM的校正曲线图。图2是不同培养液中葡萄糖浓度随时间的变化曲线图。图3a、图3b是牛乳中葡萄糖消耗量随菌浓度的变化曲线图。具体实施方式实施例1：牛乳中4种抗生素残留的检测菌种的培养和收集：将嗜热链球菌(S.thermophilus)菌株划斜面置于37℃培养12h后置于4℃冰箱中保藏以用于抗生素的检测。挑取一环S.thermophilus菌种，接种到灭菌脱脂乳中，置于37±1℃下培养15h进行活化。取活化后的菌液置于MRS培养基中进行扩大培养15h，用生理盐水洗下菌体，最后用生理盐水悬浮菌体计数后备用。血糖仪校正及适用性确定：含有细菌的牛奶与测定血糖时用的血液在整体组成成分方面差别很大，为确定PGM可否适用于牛奶体系，精确配制含不同浓度葡萄糖的牛奶作为标准液进行对照，分别用PGM测定牛奶中葡萄糖浓度来确定血糖仪的准确性和精确度，以保证试验结果的准确性。PGM是专门设计制作用来测定人体血液中葡萄糖含量的，测试用电极反应区域内发生反应往往是有严格条件限制的，在其工作范围1.1mmol·L-1～33.3mmol·L-1内，为保证该研究中测试结果的准确性，以葡萄糖标准液作为对照，检测结果如图1所示，其中C1是葡萄糖-牛乳中的葡萄糖浓度，C2是PGM所测得的葡萄本文档来自技高网...
【技术保护点】
基于PGM快速检测牛乳或鸡组织中抗生素残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种的培养和收集：将嗜热链球菌(S.thermophilus)菌株划斜面置于37℃培养12h后，挑取一环S.thermophilus菌种，接种到灭菌脱脂乳中，置于37±1℃下培养15h进行活化；取活化后的菌液置于MRS培养基中进行扩大培养15h，用生理盐水洗下菌体，最后用生理盐水悬浮菌体计数1×108cfu/mL后备用，得菌液；(2)取牛乳或匀浆后的鸡组织样本5.0g，加入葡萄糖使葡萄糖浓度为10～15.0mmol/L，再加入步骤(1)的菌液1mL；对照组为无抗牛乳或匀浆后的无抗鸡组织5.0g，加入葡萄糖使其浓度与样本相同，再加入步骤(1)的菌液1mL；空白组为无抗牛乳或匀浆后的无抗鸡组织5.0g，加入葡萄糖使其浓度与样本相同，不加菌液；80℃灭菌20min，在对应时间0min、180min取出，用电流型便携式葡萄糖传感器(PGM)测定样本、对照组和空白组中葡萄糖含量，计算葡萄糖浓度的变化(ΔC)，ΔC＝C1－C2，C1为0h时的葡萄糖浓度，C2为180min时的葡萄糖浓度；(3)计算葡萄糖发酵抑制率：葡萄糖发酵抑制率＝[(对照ΔC‑样品ΔC‑空白ΔC)/对照ΔC]×100％；(4)葡萄糖发酵抑制率等于或大于50％的，即可判定被测牛乳或鸡组织中抗生素残留为阳性。...
【技术特征摘要】
1.基于PGM快速检测牛乳或鸡组织中抗生素残留的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)菌种的培养和收集：将嗜热链球菌(S.thermophilus)菌株划斜面置于37℃培养12h后，挑取一环S.thermophilus菌种，接种到灭菌脱脂乳中，置于37±1℃下培养15h进行活化；取活化后的菌液置于MRS培养基中进行扩大培养15h，用生理盐水洗下菌体，最后用生理盐水悬浮菌体计数1×108cfu/mL后备用，得菌液；(2)取牛乳或匀浆后的鸡组织样本5.0g，加入葡萄糖使葡萄糖浓度为10～15.0mmol/L，再加入步骤(1)的菌液1mL；对照组为无抗牛乳或匀浆后的无抗鸡组织5.0g，加入葡萄糖使其浓度与样本相同，再加入步骤(1)的菌液1mL；空白组为无抗牛乳或匀浆后的无抗鸡组织5.0g，加入葡萄糖使其浓度与样本相同，不加菌液；80℃灭...
【专利技术属性】
技术研发人员：赵广英，窦文超，郭燕，
申请(专利权)人：浙江工商大学，
类型：发明
国别省市：浙江;33
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