恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒制造技术

本发明专利技术涉及乳胶法免疫层析领域，具体公开了一种恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上，所述致敏乳胶聚酯膜上包被有彩色乳胶颗粒标记的抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅰ，免疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅱ的检测线和包被了羊抗兔IgG的质控线。本发明专利技术的恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒反应灵敏，检测方便、检测结果稳定，节约成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及免疫层析
，具体涉及一种恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒及其制备与应用。
技术介绍
疟疾是经按蚊叮咬或输入带疟原虫者的血液而感染疟原虫所引起的虫媒传染病。寄生于人体的疟原虫共有四种，即间日疟原虫，三日疟原虫，恶性疟原虫和卵形疟原虫。在我国主要是间日疟原虫和恶性疟原虫；其他二种少见，近年偶见国外输入的一些病例。不同的疟原虫分别引起间日疟、三日疟、恶性疟及卵圆疟。疟疾为世界五大寄生虫病之一，有很高的发病率和死亡率，普遍存在于热带及亚热带地区，位于赤道周围的宽大带状区域。主要流行地区是非洲中部、南亚、东南亚及南美北部的热带地区，这其中又以非洲的疫情最甚。就中国而言，疟疾主要的流行地带为华中华南的丛林多山地区，但疫情远较非洲为轻。疟疾是以周期性冷热发作为最主要特征，脾肿大、贫血以及脑、肝、肾、心、肠、胃等受损引起的各种综合征。患者每年在3亿～5亿之间，因患疟疾而死亡的人数在1百万～3百万之间，其中大部分为儿童。及早、快速有效地检测疟原虫是有效防治疟疾的关键。传统的检测方法是通过血涂片显微镜检查来判断，这种方法简便、经济、准确率高，缺点是判断结果受检验人员镜检水平和视力疲劳程度等因素的影响，易导致误诊和漏检且检查效率不高，不适合大规模现场调查和短时间大批量处理样本。乳胶层析法是以彩色乳胶为标记物的免疫层析法，其检测原理与胶体金免疫层析法相类似，它不需要仪器，直接用肉眼判读结果，具有操作简单、快速，试剂稳定性好，易保存，单人份独立包装，试剂损耗少等优点，适合临床患者、健康体检者等标本的快速筛查。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服现有技术缺陷，从提高检测灵敏度出发，提供一种检测灵敏度高、特异性强、检测快速的恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒。本专利技术的第一方面公开了一种恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上，所述致敏乳胶聚酯膜上包被有彩色乳胶颗粒标记的抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅰ，免疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅱ的检测线和包被了羊抗兔IgG的质控线。较优的，所述彩色乳胶颗粒为粒径290～300nm的聚苯乙烯颗粒。较优的，所述彩色乳胶颗粒的颜色为红色。本专利技术致敏乳胶聚酯膜上标记有彩色乳胶颗粒的抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅰ和免疫硝酸纤维素膜检测线(T线)包被的抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅱ均为单克隆抗体。本专利技术的另一方面，提供了一种恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：1)致敏乳胶颗粒的制备：用羧基化的聚苯乙烯标记抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ι，获得致敏乳胶颗粒；2)致敏乳胶聚酯膜的制备：用步骤1)获得的致敏乳胶颗粒包被聚酯膜，获得致敏乳胶聚酯膜；3)将抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅱ和羊抗兔抗体分别喷在硝酸纤维素膜检测线(T线)和质控线(C线)的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；4)将滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC片上，切裁制得试剂条；5)将试剂条装入塑料盒，获得恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒。较优的，所述步骤1)致敏乳胶颗粒的制备为：a.取一定体积的羧基化的聚苯乙烯，用2～3倍体积20mMpH6.0的碳酸缓冲溶液多次冲洗、离心、弃上清，获得羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀；b.用1～1.5倍体积20mMpH6.0的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀，并加入1～1.5倍体积的水溶性炭化二亚胺，室温下搅拌20～30分钟，最后用2～3倍体积0.01MpH8.0的硼酸缓冲溶液多次冲洗、离心、弃上清，获得待标记物；c.向步骤b获得的所述待标记物中加入2～3倍体积0.2MpH7.0的硼酸缓冲液制成乳胶悬液，并向所述乳胶悬液中加入抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ι；d.充分反应过夜，加入终止剂终止反应，获得致敏乳胶颗粒。在致敏乳胶颗粒的制备过程中，加入的水溶性炭化二亚胺、各缓冲溶液的体积均以初始所取的羧基化的聚苯乙烯的体积为基准，按本专利技术所述的体积倍数加入：如所取的羧基化的聚苯乙烯颗粒的体积为1ml，则需要加入的pH6.020mM的磷酸缓冲溶液体积可以为1～1.5ml，pH7.00.2M的硼酸缓冲液的体积为2～3ml。更优的，所述步骤a中碳酸缓冲溶液为20mMpH6.0含0.01％SDS的碳酸缓冲溶液。添加有SDS的碳酸缓冲溶液可以更好的洗去乳胶的表面活性物，清洗效果更好。更优的，所述步骤a中羧基化的聚苯乙烯浓度为6～12w/v％。更优的，所述步骤a中的离心条件为12000～14000rpm，离心10min。更优的，所述步骤b中水溶性炭化二亚胺的浓度为9～10mg/ml。更优的，所述步骤b中的离心条件为12000～14000rpm，离心10min。更优的，所述步骤c乳胶悬液中羧基化的聚苯乙烯颗粒偶联抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ι的量为：0.5mg抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ι/10mg聚苯乙烯颗粒。更优的，所述步骤d中终止剂为50mMpH8.2的Tris-HCl。本专利技术中，v％指体积百分比；w/v％指重量体积百分比，如1w/v％即为100ml溶液中含1g物质。较优的，所述步骤2)中致敏乳胶聚酯膜的制备具体步骤为：A.用乳胶缓冲液稀释致敏乳胶颗粒，获得0.3～0.5w/v％的致敏乳胶溶液；B.用步骤A制备好的致敏乳胶溶液喷涂聚酯膜，干燥，制得致敏乳胶聚酯膜。更优的，所述步骤A中的乳胶缓冲液配方如下：9～11v％1.0MTris液，0.25～0.35w/v％聚乙二醇20000，0.18～0.20w/v％牛血清白蛋白，0.15～0.25w/v％脱脂牛奶，0.28～0.30w/v％酪蛋白，和0.04～0.06w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.0±0.02，余量为水。最优的，所述步骤A中的乳胶缓冲液配方如下：10v％1.0MTris液、0.3w/v％聚乙二醇20000、0.2w/v％牛血清白蛋白，0.2w/v％脱脂牛奶、0.3w/v％酪蛋白，和0.05w/v％叠氮化钠，用盐酸调节pH至8.0±0.02，余量为水。进一步较优的，为了使得试剂盒具有更佳的灵敏度和特异性，本专利技术所述的乳胶缓冲液还包括下列组分：果糖、氯化钾和甘氨酸，且果糖、氯化钾和甘氨酸的总浓度为3.25～4.75g/L，缓冲液的pH值为7.3－7.5。更优选的，各组分在乳胶缓冲液中的浓度为：果糖1.0-2.0g/L；氯化钾0.25-0.5g/L；甘氨酸2.0-2.25g/L。更优的，步骤B中用致敏乳胶溶液喷涂聚酯膜，每261mm×220mm聚酯膜上喷涂1.28ml致敏乳胶溶液，干燥，制得致敏乳胶聚酯膜。较优的，所述步骤3)中，喷在硝酸纤维素膜质控线(C线)上的羊抗兔IgG的浓度为1.0～2.0mg/ml，喷在硝酸纤维素膜检测线(T线)上的抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅱ浓度为1.0～2.0mg/ml。较优的，每50m长硝酸纤维素膜分别包被有6ml的羊抗兔Ig本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上，其特征在于，所述致敏乳胶聚酯膜上包被有彩色乳胶颗粒标记的抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅰ，免疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅱ的检测线和包被了羊抗兔IgG的质控线。

【技术特征摘要】
1.一种恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒，包括试剂条，所述试剂条包括衬底、滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸，所述滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜和吸水纸依次首尾衔接并固定于所述衬底上，其特征在于，所述致敏乳胶聚酯膜上包被有彩色乳胶颗粒标记的抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅰ，免疫硝酸纤维素膜上设有包被了抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅱ的检测线和包被了羊抗兔IgG的质控线。2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述彩色乳胶颗粒为粒径290～300nm的聚苯乙烯颗粒。3.权利要求1-2任一权利要求所述的恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：1)致敏乳胶颗粒的制备：用羧基化的聚苯乙烯标记抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ι，获得致敏乳胶颗粒；2)致敏乳胶聚酯膜的制备：用步骤1)获得的致敏乳胶颗粒包被聚酯膜，获得致敏乳胶聚酯膜；3)将抗恶性疟原虫组氨酸富集蛋白Ⅱ单克隆抗体Ⅱ和羊抗兔抗体分别喷在硝酸纤维素膜检测线和质控线的位置上，烘干备用，制得免疫硝酸纤维素膜；4)将滤样纸、致敏乳胶聚酯膜、免疫硝酸纤维素膜、吸水纸依次粘贴在PVC片上，切裁制得试剂条；5)将试剂条装入塑料盒，获得恶性疟原虫乳胶法检测试剂盒。4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述步骤1)致敏乳胶颗粒的制备为：a.取一定体积的羧基化的聚苯乙烯，用2～3倍体积20mMpH6.0的碳酸缓冲溶液多次冲洗、离心、弃上清，获得羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀；b.用1～1.5倍体积20mMpH6.0的磷酸缓冲溶液悬浮上一步获得的羧基化的聚苯乙烯颗粒沉淀，并加入1～1.5倍体积的水溶性炭化二亚胺，室温下搅拌20～30分钟，最后用2～3...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘延龙，毛远丽，
申请(专利权)人：上海凯创生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海;31