一种膝关节积液的游离DNA提取纯化的方法技术

本发明专利技术提供一种膝关节积液的游离DNA提取纯化的方法，主要特征在于两步离心法去除积液中的细胞和碎片等杂质，透明质酸酶、RNA酶、蛋白酶K联合作用，水解积液中的粘性物质和RNA杂质。通过本发明专利技术可以有效提取关节积液中的游离DNA，为研究游离DNA在关节炎相关疾病的致病机理的作用提供保障。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种膝关节积液的游离DNA提取纯化的方法，属于生物医学研究领域。
技术介绍
类风湿性关节炎（RheumatoidArthritis,RA）是一种对称性多关节炎慢性炎症性疾病，主要表现：滑膜细胞增生、炎性细胞浸润、关节软骨及骨破坏，大量自身抗体产生（类风湿因子、抗瓜氨酸抗体产生），后期会出现如心血管、肺部等全身系统性疾病。。类风湿性关节炎最先受损的是关节处关节与关节周围组织，关节表面覆盖的关节软骨降低关节的摩擦。滑膜在关节腔周围，产生关节腔积液，为关节软骨提供营养，并且润滑软骨。在类风湿性关节炎中，滑膜是最先发炎部位，表现位滑膜细胞增生，血管增生，炎症细胞包括淋巴细胞、浆细胞和激活的巨嗜细胞浸润。当滑膜增生后，最终炎症组织与临近的关节软骨形成关节翳，可以看到增殖细胞入侵软骨细胞外基质。而在发炎滑膜和相邻软骨下骨，会出现矿化骨质损坏吸收，细胞出现破骨细胞形态改变：如降血钙素受体mRNA表达，组织蛋白酶K表达，及抗酒石酸酸性磷酸酶表达。类风湿性关节炎滑膜产生大量的细胞因子刺激软骨基质破坏和骨损伤，目前，对于类风湿的分类，还主要是根据临床症状。进行对不同疾病亚型进行分子分类，对于类风湿性临床和治疗有重要意义。有研究表明类风湿性疾病与基因、环境有相互复杂作用，如人类白细胞抗原HLA-DRB1被确定和病人类风湿性因子或者瓜氨酸抗体阳性相关，在HLA-DRB1等位基因处一个普遍存在的氨基酸基序（QKRAA）具有易感性，表明偏好性T细胞选择和抗原呈递或者多肽的不同亲和力在自身免疫性疾病中有重要作用。同时，人们认为免疫反应包括获得性免疫和天然免疫在类风湿性关节炎中起重要作用。当白细胞浸润到滑膜时，引起炎症。当滑膜区的毛细血管部位内皮细胞激活时，增加粘附分子（整合素、选择素已及一些免疫蛋白超家族的分子表达）和趋化分子表达，白细胞进行迁移。由于新生血管的产生，和淋巴血管增生不充分，限制了细胞的流出，形成滑膜炎。微环境系统的改变，与进一步滑膜结构的重组和局部纤维细胞的活化，形成了类风湿性关节炎的滑膜炎。在类风湿性关节炎中，由于自身抗体的存在，使获得性免疫在其中起到重要作用。但同时，在滑膜表面存在大量的天然免疫效应细胞，包括巨嗜细胞、肥大细胞，和自然杀伤细胞，以及存在于关节腔滑液中的中性粒细胞。巨嗜细胞是引起滑膜炎的重要因素。巨嗜细胞能够被病原相关分子与损伤相关分子识别的Toll样受体激活。Toll样受体是目前被研究最透彻的分子识别受体。在人类至少有10种，鼠类大约有12种。每种Toll样受体识别不同的模式分子。Toll样受体被激活后，激活细胞内通路，导致炎症细胞因子，免疫刺激细胞因子，趋化因子，共刺激因子表达，增强杀伤病原的能力并促进获得性免疫的形成。不恰当的toll样受体的激活，另一方面导致很多疾病的产生如：系统性红斑狼疮，浓毒血症，炎性肠炎，牛皮廯，多发性硬皮症，类风湿性关节炎，动脉粥样硬化。组织一旦收到感染或者损伤，受损的组织会释放各种细胞内因子，刺激天然免疫细胞。核酸来自于宿主细胞和细胞内微生物，能够被识别核酸的toll样受体识别。在病人中，已经发现休克、系统性红斑狼疮或者类风湿性关节炎患者中血清中的游离核酸与致病性相关。游离核酸是指无细胞状态的、游离于细胞外的部分降解了的机体内源性核酸，主要由单链或者双链DNA，及单链与双链DNA的混合物组成，片段大小不一。目前，对于游离核酸在疾病的早期诊断、预后、监测等方面的研究，已经引起极大关注。但已有的游离DNA提取方法只是针对血液中的游离核酸提取，对于类风湿性关节炎等疾病而言，积液中的游离核酸所包含的信息对于关节炎类疾病的诊断和治疗具有非常重要的意义。但是，关节积液中含有透明质酸，蛋白聚糖，糖胺聚糖等物质，粘性较大。而且，关节腔积液中的游离核酸从量上，到大小分布上，与血液中的游离核酸极有可能完全不同，使用现有的游离DNA提取方法很难操作，提取的游离DNA收率极低，影响后续的科学研究。本专利通过本实验室的探索与实践，提供一个有效的从积液中提取核酸的方法，该方法提取的游离核酸能够以最高效率的将关节积液中全部的游离DNA提取出来，并保证其完整性，确保后续研究的顺利进行。
技术实现思路
本专利技术拟提供一种膝关节积液的游离DNA提取纯化的方法，可以有效分离得到膝关节积液中游离DNA，为研究游离DNA在类风湿关节炎中的作用提供保障。本专利技术拟采取的具体步骤如下：1)得到关节积液，离心，2至5℃，2800至3500转每分钟，10至20分钟；2)弃掉沉淀，上清液转移至新的离心管中，离心，2至5℃，10000至15000转每分钟，20至30分钟；3)弃掉沉淀，上清液0.22微米过滤至新的离心管中；4)室温平衡5至10分钟；5)加入透明质酸酶和RNA酶,37℃孵育2至4小时；6)加入蛋白酶K，60℃孵育30至45分钟；7)加入1/5体积的CTAB缓冲液，65℃，孵育10至15分钟；8)加入等体积的氯仿，充分混合，20至25℃离心，10000至15000转每分钟，10至20分钟；9)取水相层，转移至新的离心管中，使用试剂盒提取DNA，得到关节积液游离DNA。本专利技术中，使用的透明质酸酶的最终浓度范围是300至1000酶活单位每毫升。本专利技术中，使用的RNA酶的最终浓度范围是10至20微克每毫升。本专利技术中，使用的蛋白酶K的最终浓度范围是50至100微克每毫升。本专利技术中，使用的CTAB缓冲液，配制方法为，将十六烷基三甲基溴化铵（HexadecyltrimethylammoniumBromide，CTAB）溶于0.7摩尔每升的氯化钠缓冲液中，浓度为10%（w/v），56℃水浴搅拌，完全溶解。本专利技术中，使用的游离DNA提取试剂盒是QIAGEN公司的试剂盒QIAampCirculatingNucleicAcidKit。本专利技术的有益效果是：本专利技术首先通过两步离心法分别去除积液中的细胞和碎片等杂质，第一步低速离心可以防止高速离心引起细胞破裂导致细胞内DNA外溢污染样品；通过透明质酸酶水解积液中的透明质酸，降低积液的粘度；RNA酶水解积液中RNA杂质；蛋白酶K水解积液中的蛋白质，释放DNA。通过本专利技术的处理可以有效降低积液的粘度，并去除RNA等杂质，释放积液中的游离DNA，配合使用商业化的DNA提取试剂盒，可以得到高收率的积液游离DNA。以此方法制备的游离DNA为模版，利用PCR，可以得到目的片段，即通过本专利技术处理积液，得到的游离DNA可以作为后续研究中的模版，为研究游离DNA在关节炎相关疾病的致病机理提供保障。附图说明图1，三种方法提取得到游离DNA琼脂糖凝胶电泳结果图，其中，Ａ泳道为第一种方法提取的游离DNA，B泳道为第二种方法提取的游离DNA，C泳道为第三种方法提取得到的游离DNA。图2，类风湿性关节炎患者积液游离DNA的PCR电泳图。图3，类风湿性关节炎患者积液游离DNA的Agilent2100生物分析仪结果图。具体实施方式实施例1本实施例设计三种不同方法，对比提取积液游离DNA的产量，确定最佳方法，其中方法二为本专利技术提出的方法。取类风湿性关节炎患者膝关节积液10毫升，离心，4℃，3000转每分钟，10分钟；弃掉沉淀，上清液转移至新的离心管中，离心，4℃，10000转每分钟，20分钟；本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种膝关节积液的游离DNA提取纯化的方法，其特征在于采取如下步骤：1)得到关节积液，离心，2至5℃，2800至3500转每分钟，10至20分钟；2)弃掉沉淀，上清液转移至新的离心管中，离心，2至5℃，10000至15000转每分钟，20至30分钟；3)弃掉沉淀，上清液0.22微米过滤至新的离心管中；4)室温平衡5至10分钟；5)加入透明质酸酶和RNA酶, 37℃孵育2至4小时；6)加入蛋白酶K，60℃孵育30至45分钟；7)加入1/5体积的CTAB缓冲液，65℃，孵育10至15分钟；8)加入等体积的氯仿，充分混合， 20至25℃离心，10000至15000转每分钟，10至20分钟；9)取水相层，转移至新的离心管中，使用试剂盒提取DNA，得到关节积液游离DNA。

【技术特征摘要】
1.一种膝关节积液的游离DNA提取纯化的方法，其特征在于采取如下步骤：1)得到关节积液，离心，2至5℃，2800至3500转每分钟，10至20分钟；2)弃掉沉淀，上清液转移至新的离心管中，离心，2至5℃，10000至15000转每分钟，20至30分钟；3)弃掉沉淀，上清液0.22微米过滤至新的离心管中；4)室温平衡5至10分钟；5)加入透明质酸酶和RNA酶,37℃孵育2至4小时；6)加入蛋白酶K，60℃孵育30至45分钟；7)加入1/5体积的CTAB缓冲液，65℃，孵育10至15分钟；8)加入等体积的氯仿，充分混合，20至25℃离心，10000至15000转每分钟，10至20分钟；9)取水相层，转移至新的离心管中，使用试剂盒提取...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘利新，董聪，孙成新，陈永明，
申请(专利权)人：中山大学，
类型：发明
国别省市：广东;44