一种应用角质酶变温催化莱苞迪苷B制备莱苞迪苷D的方法技术

本发明专利技术公开了一种应用角质酶变温催化莱苞迪苷B制备莱苞迪苷D的方法，属于有机化合物的生物合成技术领域。本发明专利技术以来源于Thermobifida fusca的角质酶，催化RB与槐糖的酯化反应；通过程序降温反应，降低酶的热失活并提高传质效应。本发明专利技术提供的方法，能够在甲醇、DMSO、DMF等溶剂中催化RB生成RD的反应，安全、高效、选择性高。此外，通过分阶段变温酯化，既加快反应的初速度，又通过生成的RD增溶RB，改善传质，加快反应速度。总的来说，本发明专利技术反应条件温和、产率高、产物分离纯化简单。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种应用角质酶变温催化莱苞迪苷B制备莱苞迪苷D的方法，属于有机化合物的生物合成

技术介绍
莱苞迪苷D(RD)，(4R)-13-[[2-O-(β-D-Glucopyranosyl)-3-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosyl]oxy]kaur-16-en-18-oicacid2-O-(β-D-glucopyranosyl)-β-D-glucopyranosylester，是一种微量存在于甜叶菊中的天然甜味剂，其味质比目前通用的、可大量获得的莱苞迪苷A(RA)更接近蔗糖。RD一般用于RA或其它甜味剂的增味。RD作为甜菊糖产品中少量含有的物质在2010年9月通过了GRAS认证，作为高纯化合物在2015年4月通过了GRAS认证。目前RD的获得主要靠植提，其人工合成还少见报道。RD的结构类似物莱苞迪苷B(RB)，13-O-[β-D-glucopyranosyl(1→2)-(β-D-glucopyranosyl(1→3))-β-D-glucopyranosyl]-ent-13-hydroxy-kaur-16-en-19-oicacid，是莱苞迪苷D水解掉碳19位的槐糖后得到的一种甜菊苷，也是一种少量(一般不超过0.1％)存在于甜叶菊中的天然甜味剂，有后苦味，但它可以通过酶或碱催化水解RA脱除RA碳19位的一分子葡萄糖而大量获得。因此从结构上分析，可以通过RB的槐糖酯化来大量制备RD。酯化反应可以通过酸或酶催化来进行。一方面，酸催化的酯化容易发生，但是要先保护RB分子碳13位上糖的羟基，以避免RB分子间的酯化。常见的糖羟基保护有众所周知的乙酰化反应，也曾用于三氯蔗糖合成中的糖羟基保护。另一方面，酶催化酯化比化学催化酯化温和，专一性强但。如果RB的槐糖酯化能够通过专一的选择性酯化实现，就可以避免保护和脱保护反应。糖酯的酶催化合成也多见报道，常用的有十多种商品化的脂肪酶，但其中应用最广泛的还是Novozym435。例如用Novozym435催化月桂酸和蔗糖在叔丁醇中的反应，可得到月桂酸蔗糖单酯和月桂蔗糖二酯。再如用Novozym435可催化合成海藻糖硫辛。不同来源的酶对于底物酰化试剂链长具有不同的选择性，多种来源于细菌和真菌的微生物细胞能够催化葡糖单酯合成反应，且假单胞菌属和真菌全细胞的反应活性与培养基中碳源种类显著。但是，RB是含有3个糖分子残基的酸，和上述脂肪酸完全不同。通过对现有二十余种商品脂肪酶的筛选，没有发现能够催化RB的槐糖酯化反应的脂肪酶。这可能是由于RB的溶解性问题，以及RD上羧基较大的空间位阻，故而上述脂肪酶均不能催化RB与槐糖的酯化反应；此外，RB的良溶剂往往对脂肪酶的活性有较大损伤，这也使得RB的酶催化槐糖酯化一直难以实现。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种应用角质酶催化莱苞迪苷B制备莱苞迪苷D的方法，具有转化率高、速度快、选择性高、分离纯化简单等优点。所述方法是以来源于Thermobifidafusca的角质酶，催化RB与槐糖的酯化反应；通过程序降温反应，降低酶的热失活并提高传质效应。来源于Thermobifidafusca的角质酶催化RB与槐糖的酯化反应制备RD的反应方程式如下：具体地，所述方法以RB为底物，将底物用溶剂配制成10-20g/L的反应液；55℃下加入来源于Thermobifidafusca的角质酶，搅拌均匀后升温至70℃反应0.5-1h，补加10-20g/L的RB，再在60℃下反应1-1.5h后补加30-50g/L的RB，在60℃下继续反应2-6h。。所述角质酶是酶液、粉末状酶制剂或固定化酶。所述固定化的方法可以是物理、化学或生物方法，例如以树脂吸附固定，或者以磁珠亲和吸附添加了组氨酸标签的角质酶。所述溶剂为加有pH6.0的磷酸缓冲液的甲醇、二甲基亚砜、二甲基甲酰胺中的一种或几种的混合。其中pH6.0的磷酸缓冲液的加入量为有机溶剂质量的0.01％-0.05％。在本专利技术的一种实施方式中，加酶量为100-500U/gRB。在本专利技术的一种实施方式中，反应停止后，将反应液减压蒸出溶剂后，用90％甲醇水溶液将反应混合物重结晶2到3次即得到白色产品RD。在本专利技术的一种实施方式中，60℃下酶催化反应至RB转化率为60％后，加入4A分子筛脱除部分水；继续反应，当RB转化率达到70％-78％，停止加热，将反应液减压蒸出溶剂后，用90％甲醇水溶液将反应混合物重结晶2到3次即可得到白色产品RD。所蒸出的溶剂可以循环使用。角质酶(EC3.1.1.74)是一种α/β水解酶，属于丝氨酸酯酶，可以降解角质并产生脂肪酸单体。角质酶既可以催化水解不溶性多聚体植物角质的酯键，也可以催化水解其它长链、短链脂肪酸酯、乳化的甘油三酯和可溶性的合成酯等，是一种多功能裂解酶。与其它脂肪酶相比，角质酶的纤维素结合结构域有利于酶分子和纤维素的高效结合，因此与糖和寡糖也可能有更好的结合。本专利技术提供了一种制备RD的新方法，能够在甲醇、DMSO、DMF等溶剂中催化RB生成RD的反应，安全、高效、选择性高。此外，通过分阶段变温酯化，既加快反应的初速度，又通过生成的RD增溶RB，改善传质，加快反应速度。总的来说，本专利技术反应条件温和、产率高、产物分离纯化简单。附图说明图1实施例1制得的RD的鉴定；aRD标样(99.7％)的HPLC，bRD(95.7％)的HPLC，cRD(95.7％)的1HNMR谱图，cRD(95.7％)的13CNMR谱图。具体实施方式RD的检测方法：用改良的JECFA方法(SteviolGlycosidesINSNo.960)，以HPLC检测样品。样品浓度1mg/mL。色谱条件：C18柱，4.6×250mm，31.3％乙腈(用磷酸盐调至pH2.6)等度洗脱，流速1mL/min，柱温40℃，紫外检测波长210nm，进样量10μL。RB转化率的计算公式：RB(%)=C0-C(RB)C0---(1)]]>C0——RB的初始浓度C(RB)——反应后剩余RB的浓度RB质量分数按照下式进行计算(参考2014国标GB8270-2014)：wa=mRm×AaAR×100%---(2)]]>mR——莱苞迪苷A标准溶液中瑞鲍迪苷A的质量(以干基计)，单位为毫克(mg)；m——试样溶液中试样的质量(以干基计)，单位为毫克(mg)；Aa——试样溶液色谱图中瑞鲍迪苷A的峰面积值；AR——莱苞迪苷A标准溶液色谱图中瑞鲍迪苷A的峰面积值。RB或RD的质量分数按照式(3)计算：wi=mSm×fi×AiAS×100%---(3)]]>i——分别代表RB或RD；ms——甜菊苷标准溶液中甜菊苷的质量，单位为mg；fi——i组分与甜菊苷的式量比值：RD的fi为1.40；Ai——试样溶液色谱图中i组分的峰面积值；As——甜菊苷标准溶液色谱图中甜菊苷的峰面积值。角质酶的制备方法，参见专利号为ZL200810020124.0，专利技术名称为“一种高温角质酶及其基因序列”，授权公告日为2010年4月14日的中国专利申请。实施例1将RB用含pH6.0的磷酸缓冲液的二甲基亚砜(pH6.0的磷酸缓冲液的加入量为溶剂质量的0.03本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种催化莱苞迪苷B制备莱苞迪苷D的方法，其特征在于，以来源于嗜热子囊菌(Thermobifidafusca)的角质酶，催化莱苞迪苷B与槐糖的酯化反应，酯化反应过程中分阶段降低反应温度。

【技术特征摘要】
1.一种催化莱苞迪苷B制备莱苞迪苷D的方法，其特征在于，以来源于嗜热子囊菌(Thermobifidafusca)的角质酶，催化莱苞迪苷B与槐糖的酯化反应，酯化反应过程中分阶段降低反应温度。2.根据权利要求1所述的一种催化莱苞迪苷B制备莱苞迪苷D的方法，其特征在于，反应方程式如下：3.根据权利要求1所述的一种催化莱苞迪苷B制备莱苞迪苷D的方法，其特征在于，以莱苞迪苷B为底物，将底物用溶剂配制成10-20g/L的反应液；55℃下加入来源于Thermobifidafusca的角质酶，搅拌均匀后升温至70℃反应0.5-1h，补加10-20g/L的RB，再在60℃下反应1-1.5h后补加30-50g/L的RB，在60℃下继续反应2-6h。。4.根据权利要求1-3任一所述的一种催化莱苞迪苷B制备莱苞迪苷D的方法，其特征在于，所述角质酶是酶液、粉末状酶制剂或固定化酶。5.根据权利要求4所述的一种催化莱苞迪苷B制备莱苞迪苷D的方法，其特征在于，所述固...

【专利技术属性】
技术研发人员：邢海根，孙景文，王海军，夏咏梅，
申请(专利权)人：江南大学，山东海根生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32