一种重组犬干扰素α标准品、其制备方法及效价测定方法技术

本发明专利技术公开了一种重组犬干扰素α标准品、其制备方法及效价测定方法。将表达重组犬干扰素α的BL21/pET‑28α‑rCaIFNα重组菌进行发酵和诱导，后直接收集菌体破碎后上清提取总蛋白；然后采用三步纯化法后得到该制剂的纯品，向纯品中加入冻干保护剂进行真空冷冻干燥后得到标准品，其效价为1.0×104IU/mL；SDS‑PAGE检测其纯度为97.34％；HPLC检测其纯度为99.79％；相对分子量为33KD。此方法制备的重组犬干扰素α作为标准品可用于重组犬干扰素α特性鉴别和效价测定的比对，以此为标准可使不同批次测定的重组犬干扰素α效价检测结果更为可靠可信。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种重组干扰素标准品的制备方法，具体涉及一种重组犬干扰素α标准品、其制备方法及效价测定方法。
技术介绍
随着社会进步和人民生活方式的改变，犬作为伴侣动物已成为人们生活的一部分。犬瘟热、犬细小等病毒性传染病严重危害养犬业的发展，目前无有效治疗药物，主要用疫苗接种进行预防，但免疫效果欠佳。同时，狂犬病等人畜共患病也引起人们的重视，因此，采用一种安全无副作用的药物来预防和治疗犬病毒病就显得尤为重要。干扰素是一类由病毒及脂多糖等物质诱导机体产生的具有广谱抗病毒、抗肿瘤和免疫调节作用的蛋白质，1957年由Issacs和Lindeman首先发现，它是一类多功能的细胞因子，与细胞受体结合后，可诱导机体产生多种特异性蛋白质和酶类，主要通过抑制病毒基因转录和降解病毒RNA来抑制病毒的生长繁殖及发挥抗肿瘤等的活性。按照干扰素的产生细胞、生化特征及在机体免疫方面所发挥的作用不同，分为α、β、γ三种型。现已知，干扰素α在体内可有选择性地作用于病毒感染细胞，通过抑制受染细胞内的病毒蛋白质的生物合成，发挥广谱和高效抗病毒作用，但对正常宿主细胞无作用。Himmler等在1987年首先对犬干扰素α进行了研究，我国也在1999年开始进行了相关研究，并得到了一系列犬干扰素相关产品。对于生物制品来说，其质量评价的有效性指标多采用生物学方法，如动物法和细胞法等进行检测，这些方法本身变异性较大，因此，标准品是生产中必不可少的组成部分，在生物制品标准化、质量控制和效力评价中，标准品是药品质量评价的标尺，起着非常重要的作用。目前已有人干扰素标准品面世，猪的干扰素标准品已获得专利技术专利，然而目前国际国内均没有重组犬干扰素α的标准品，由于干扰素具有种属特异性，人或者猪的的干扰素标准品并不适用于犬干扰素，这给犬干扰素在防治病毒性疾病中应用研究和生产工作带来很多不便。
技术实现思路
本专利技术提供了一种重组犬干扰素α标准品的制备方法，按照此方法制备的重组犬干扰素α抗病毒活性标准品效价为：1.0×104IU/mL；SDS-PAGE检测其纯度为97.34％；HPLC检测其纯度为99.79％；相对分子量为33KD。本专利技术还提供了按照上述制备方法制备得到的重组犬干扰素α标准品，其N-末端氨基酸序列从第十个氨基酸开始为CHLPDTHSLRWRVLTL。本专利技术还提供了重组犬干扰素α标准品的效价测定方法。本专利技术采取的技术方案为：一种重组犬干扰素α标准品的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：(1)将重组犬干扰素α的重组菌进行发酵和诱导，直接收集菌体破碎后上清提取总蛋白，所述重组犬干扰素α的重组菌为BL21/pET-28α-rCaIFNα工程菌；(2)总蛋白经亲和层析纯化、阴离子交换层析纯化、分子筛层析纯化，即可得到重组犬干扰素α纯化后蛋白溶液；(3)重组犬干扰素α纯化后蛋白溶液过滤除菌、稀释后加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，即可制得重组犬干扰素α标准品。所述步骤(1)具体包括以下步骤：(1-1)培养工程菌BL21/pET-28α-rCaIFNα，得到工程菌菌液；(1-2)将工程菌菌液按体积比1：10接种到LB培养基中，培养后作为发酵种子菌液；(1-3)发酵种子菌液接种到装有LB培养基的发酵罐中进行发酵、诱导，得到发酵液；(1-4)发酵液离心、破碎后收集上清液，即可得到重组犬干扰素α蛋白。所述步骤(1-3)具体包括以下步骤：将发酵种子菌液接种到装有LB培养基的发酵罐中，发酵种子菌液与LB培养基的体积比为1:10，设置温度为37℃、溶氧为30％、转速为200～220r/min、pH为7.0～7.4条件下发酵；当发酵罐内的OD600达到1.0时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.5mmol/L，继续诱导表达4～6h，得到发酵液。所述步骤(1-3)还包括：接种发酵种子菌液之前，装有LB培养基的发酵罐要进行原位灭菌，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min。所述步骤(1-4)具体包括以下步骤：将发酵液4℃条件下4000r/min离心10min，收集菌体，用200ml生理盐水重悬菌体，在900bar压力下高压细胞破碎，重复破碎两次，4℃条件下8000r/min离心15min，收集上清；重复离心一次，收集上清液，即可得到重组犬干扰素α蛋白。所述亲和层析纯化所用的洗脱液为50mMTris与20mM～500mM咪唑组成的混合液，pH为8.0～9.0。梯度洗脱，20mM～200mM咪唑洗脱杂蛋白，200mM～500mM咪唑洗脱目的蛋白。此步骤可以去除80％杂蛋白，使纯度达到80％。然后透析于50mMTris与50mMNaCl组成的混合液,pH为6.5。所述阴离子交换层析所用的洗脱液为50mMTris与500mMNaCl组成的混合液，其pH值为6.5。洗脱下来的目的蛋白纯度在90％以上。所述分子筛层析所用的洗脱液为50mMNa2HPO4与0.15MNaCl组成的混合液，其pH值为7.4。此步既可以更换缓冲液为磷酸盐缓冲液，又可以去除小分子杂蛋白，洗脱下来的目的蛋白纯度在98％左右。采用以上三种层析柱进行纯化，既可以使得目的蛋白纯度达到95％以上，又可以去除大量的内毒素。所述步骤(3)具体包括以下步骤：将重组犬干扰素α纯化后蛋白溶液用0.22μm滤膜过滤除菌，用PH值为7.4的10mmol/LPBS稀释后加入终浓度达10％(质量百分浓度)甘油、0.12g/ml甘露醇、0.025g/ml蔗糖冻干保护剂混匀后，以2.2ml西林瓶容量分装，真空冷冻干燥后即可制得重组犬干扰素rCaIFN-α标准品。本专利技术还提供了按照上述制备方法制备得到的重组犬干扰素α标准品，其N-末端氨基酸序列从第十个氨基酸开始为CHLPDTHSLRWRVLTL。所述重组犬干扰素α标准品的效价为1.0×104IU/mL；SDS-PAGE检测其纯度为97.34％；HPLC检测其纯度为99.79％；相对分子量为33KD。本专利技术提供了重组犬干扰素α标准品的效价测定方法，牛肾细胞作为测试细胞，重组犬干扰素α标准品作为供试品，重组人干扰素α标准品作为对照品，将供试品和对照品分别制成不同的稀释度，在MDBK/VSV系统上对重组犬干扰素α标准品效价进行标定。按照本专利技术方法制得的重组犬干扰素α标准品为冻干制剂，其优点为：效价高、稳定，以现有人标准干扰素作为参比准确，生产成本低廉。目前国际国内均没有重组犬干扰素α的标准品，本专利技术提供一种重组犬干扰素α生物学活性检测用标准品的制备方法，为建立重组犬干扰素α质量标准奠定基础。按此方法制备的重组犬干扰素α作为标准品可用于重组犬干扰素α特性鉴别和效价测定的比对，以此为标准可使不同批次测定的重组犬干扰素α效价检测结果更为可靠可信。附图说明图1为重组犬干扰素αHPLCC18反相层析C蛋白纯度检测结果图图2为重组犬干扰素α免疫印迹检测结果图具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明均为自常规生化试剂商店购买得到的；所涉及的PBS缓冲溶液的pH值均为7.4；工程菌BL21/pET-28α-rCaIFNα的构建方法参见2008年1月9日公开的中国专利本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组犬干扰素α标准品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)将重组犬干扰素α的重组菌进行发酵和诱导，直接收集菌体破碎后上清提取总蛋白，所述重组犬干扰素α的重组菌为BL21/pET‑28α‑rCaIFNα工程菌；(2)总蛋白经亲和层析纯化、阴离子交换层析纯化、分子筛层析纯化，即可得到重组犬干扰素α纯化后蛋白溶液；(3)重组犬干扰素α纯化后蛋白溶液过滤除菌、稀释后加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，即可制得重组犬干扰素α标准品。

【技术特征摘要】
1.一种重组犬干扰素α标准品的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：(1)将重组犬干扰素α的重组菌进行发酵和诱导，直接收集菌体破碎后上清提取总蛋白，所述重组犬干扰素α的重组菌为BL21/pET-28α-rCaIFNα工程菌；(2)总蛋白经亲和层析纯化、阴离子交换层析纯化、分子筛层析纯化，即可得到重组犬干扰素α纯化后蛋白溶液；(3)重组犬干扰素α纯化后蛋白溶液过滤除菌、稀释后加入冻干保护剂，经真空冷冻干燥，即可制得重组犬干扰素α标准品。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1)具体包括以下步骤：(1-1)培养工程菌BL21/pET-28α-rCaIFNα，得到工程菌菌液；(1-2)将工程菌菌液按体积比1：10接种到LB培养基中，培养后作为发酵种子菌液；(1-3)发酵种子菌液接种到装有LB培养基的发酵罐中进行发酵、诱导，得到发酵液；(1-4)发酵液离心、破碎后收集上清液，即可得到重组犬干扰素α蛋白。3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述步骤(1-3)具体包括以下步骤：将发酵种子菌液接种到装有LB培养基的发酵罐中，发酵种子菌液与LB培养基的体积比为1:10，设置温度为37℃、溶氧为30％、转速为200～220r/min、pH为7.0～7.4条件下发酵；当发酵罐内的OD600达到1.0时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷至终浓度为0.5mmol/L，继续诱导表达4～6h，得到发酵液。4.根据根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述亲和层析纯化所用的洗脱液为50mM三羟甲基氨基甲烷与20mM～5...

【专利技术属性】
技术研发人员：赵俊，王明丽，李树启，赵雨，戚仕梅，符修乐，赖鹏飞，马腾飞，王利利，高耀辉，汪良青，周炜，
申请(专利权)人：安徽九川生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：安徽;34