本发明专利技术公开了一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒，所述检测试剂盒包括用于检测乳粉中嗜酸乳杆菌成分的特异性扩增引物对。同时，本发明专利技术还公开了一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速检测方法，包括待测样品预处理、待测样品总DNA提取、PCR扩增、琼脂糖凝胶电泳、分析判断步骤。此外，本发明专利技术还公开了所述快速定性检测试剂盒在制备嗜酸乳杆菌的检测试剂中的应用以及在检测乳粉中嗜酸乳杆菌成分中的应用。本发明专利技术设计的特异性引物对，并构建快速定性检测试剂盒，应用于嗜酸乳杆菌成分的定性检测，其检测方法准确、快速，具有较好的工业应用价值。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物工程领域，具体地说，是关于一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒、快速定性检测方法及应用。
技术介绍
益生菌(Probiotics)是一类能够促进宿主肠内微生物菌群的生态平衡，对宿主健康和/或生理功能产生有益作用的活性微生物。其作用主要是经摄入宿主体内后，能改善肠道菌群结构，促进肠道中有益菌的增殖，抑制有害菌的生长，提高机体特异性或非特异性免疫力，从而有利于抵御各种疾病的发生。近年来，作为一类对人类有独特的营养与保健作用的微生物，益生菌越来越受到人们广泛关注。目前，市场上很多品牌纷纷推出益生菌婴幼儿配方乳粉产品，所添加的益生菌包括乳杆菌、嗜酸乳杆菌，出现了不同益生菌组合配方，宣称具有不同的功效。商家宣传通过添加益生菌，能对婴幼儿肠道功能进行调节，促进婴幼儿免疫力发展，成为一个新的卖点。而有部分配方乳粉并未对添加菌种进行明确标识，使消费者处于陷入模糊消费的境地。WHO/FAO联合出台的《食品中益生菌评价指南》中定义，添加在食品中的益生菌必须具备三大条件：第一，必须摄入足够的数量；第二，必须对人或动物健康有益；第三，必须是活的微生物。明确指出益生菌功效具有菌株特异性；要求食品包装上要注明使用菌的菌株名称、储存条件及货架期内活性菌的数量。为了规范益生菌在食品中的使用，国家卫计委相继颁布了相应的法律法规。该规定包括使用菌种、标签标识、活菌数量的相关规定。关于使用菌种，2010年，卫计委发布了卫办监督发〔2010〕65号《可用于食品的菌种名单》，2011年第25号公告制定了《可用于婴幼儿食品的菌种名单》。2016年第6号公告将发酵乳杆菌CECT5716列入《可用于婴幼儿食品的菌种名单》。目前，我国卫计委允许在婴幼儿配方乳粉中允许使用的乳杆菌菌株为嗜酸乳杆菌NCFM、鼠李糖乳杆菌HN001、发酵乳杆菌CECT5716。目前中国市场流通领域产品主要以添加嗜酸乳杆菌NCFM为主。随着消费者对新兴产品追求的热度提升和维权意识的提高，益生菌婴幼儿配方乳粉的安全监管需求将会凸显，急需开发新的检测技术，对该类产品中菌种的添加种类进行深入研究，进一步提升婴幼儿配方乳粉的质量安全监管能力。现有乳酸菌检测方法标准有《GB4789.35-2010食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》，该方法仅能对乳杆菌属进行常见种的生化分型，存在鉴定操作复杂，结果不好判读的缺陷，不能满足相关领域的需要，也无法满足按照卫生部要求添加特定菌株的监管需求。为了能够确保所添加的乳酸菌为符合我国国家规定婴幼儿配方食品中允许使用的菌种，有必要建立一种快速、简便、高效、准确的乳粉中嗜酸乳杆菌的快速定性检测方法。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒，以使嗜酸乳杆菌成分的检测快速、准确；本专利技术的第二个目的是提供一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测方法，以解决现有的用于检测嗜酸乳杆菌成分的方法复杂、结果不好判读的缺陷；本专利技术的第三个目的是提供一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测盒的应用，用于乳粉中嗜酸乳杆菌成分的检测和鉴定。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案：作为本专利技术的第一个方面，一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒，包括用于检测乳粉中嗜酸乳杆菌成分的特异性扩增引物对，所述特异性扩增引物对的序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。作为本专利技术的第二个方面，一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测方法，该方法包括如下步骤：A、待测样品预处理；B、提取待测样品总DNA；C、以待测样品总DNA为模板进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；其中，PCR扩增体系中包括如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的引物对序列；D、对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；E、分析待测样品中是否含有嗜酸乳杆菌：如果待测样品DNA组在746bp附近出现特异性条带，则待测样品中含有嗜酸乳杆菌，反之待测样品中不含有嗜酸乳杆菌。根据本专利技术，步骤C的PCR反应的条件如下：PCR扩增程序为：95℃，4min；95℃，30s，66℃，30s，72℃，40s，共35个循环；72℃，5min；PCR扩增的反应体系为：2×ColorlessReactionBuffer12.5μL；1μL5μmol·L-1如SEQIDNO.7所示的引物和1μL5μmol·L-1如SEQIDNO.8所示的引物，样品DNA2μL，ddH2O8.5μL，总体积25μL。根据本专利技术，所述的待测样品为添加有嗜酸乳杆菌的婴幼儿配方乳粉。根据本专利技术，步骤A所述的待测样品预处理的方法包括：称取均质混匀的待测样品25g，置于装有225mL生理盐水的无菌均质杯内，于8000r/min～10000r/min均质1min～2min，制成1:10样品匀液；或置于225mL生理盐水的无菌均质袋中，用拍击式均质器拍打1min～2min制成1:10的样品匀液；接着选择2个～3个连续的适宜稀释度，于MRS培养基琼脂平板(36℃±1℃)需氧培养48h±2h后，挑2个或2个以上单菌落转划MRS平板扩增，获得供DNA提取的单克隆菌株菌苔。根据本专利技术，步骤B的待测样品总DNA的提取方法为：从2个或2个以上步骤A的平板上挑取单克隆菌株菌苔，加入200μL50mg/mL溶菌酶溶液，37℃保温2h；接着，依次加入10μL20mg/mL蛋白酶K和400μLSDS裂解液[含12.4g/LSDS，0.5mol/LNacl，0.1mol/LTris-HCl，0.05mol/LNa2EDTA，PH8.0]，56℃中水浴2h，而后用酚/氯仿法抽提DNA，测定DNA浓度和纯度，获得待测细菌基因组DNA。作为本专利技术的第三个方面，一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒在制备嗜酸乳杆菌的检测试剂中的应用。一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒在检测乳粉中嗜酸乳杆菌成分中的应用。一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的特异性引物对，所述特异性引物对的序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术所采用的婴幼儿配方乳粉样本的预处理方法和DNA提取方法(包括添加溶菌酶、蛋白酶K等充分对细菌破壁)，使得在益生菌的提取过程中，嗜酸乳杆菌基因组DNA可以充分释放，为一种特异的适用于婴幼儿配方乳粉中嗜酸乳杆菌提取的方法，为本专利技术首创。(2)本专利技术对目前已经报道的嗜酸乳杆菌及食品中可能添加的如鼠李糖乳杆菌、发酵乳杆菌、双歧杆菌、以及其他乳杆菌如干酪乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌等其他乳杆菌的基因组序列进行了比对分析，选择了嗜酸乳杆菌特异的SPIDR区基因片段作为目的基因，设计了特异性的引物，以该引物对婴幼儿配方乳粉中的嗜酸乳杆菌进行定性检测，该引物具有菌种特异性。(3)本专利技术可以在不进行益生菌纯培养的基础上，简便、快速、准确地定性、定量检测婴幼儿配方乳粉中嗜酸乳杆菌，整个过程对婴幼儿配方乳粉中嗜酸乳杆菌的检测程序简单、检测效率高、准确性好，灵敏度高，重复性好。附图说明图1为ITS-1引物对扩增各种乳杆菌图。图2为ITS-2引物对扩增各种乳杆菌图。图3为S1引物对扩增各种乳杆菌图。图4为S3引物对扩增各种乳杆菌图。图5为S2引物对扩增各种本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测乳粉中嗜酸乳杆菌成分的特异性扩增引物对，所述特异性扩增引物对的序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
【技术特征摘要】
1.一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测试剂盒，其特征在于，包括用于检测乳粉中嗜酸乳杆菌成分的特异性扩增引物对，所述特异性扩增引物对的序列如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示。2.一种乳粉中嗜酸乳杆菌成分的快速定性检测方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：A、待测样品预处理；B、提取待测样品总DNA；C、以待测样品总DNA为模板进行PCR扩增，获得PCR扩增产物；其中，PCR扩增体系中包括如SEQIDNO.7和SEQIDNO.8所示的引物对序列；D、对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳；E、分析待测样品中是否含有嗜酸乳杆菌：如果待测样品DNA组中在746bp附近出现特异性条带，则待测样品中含有嗜酸乳杆菌，反之待测样品不含有嗜酸乳杆菌。3.如权利要求2所述的快速定性检测方法，其特征在于，步骤C的PCR反应的条件如下：PCR扩增程序为：95℃，4min；95℃，30s，66℃，30s，72℃，40s，共35个循环；72℃，5min；PCR扩增的反应体系为：2×ColorlessReactionBuffer12.5μL；1μL5μmol·L-1如SEQIDNO.7所示的引物和1μL5μmol·L-1如SEQIDNO.8所示的引物，样品DNA2μL，ddH2O8.5μL，总体积25μL。4.如权利要求2所述的快速定性检测方法，其特征在于，所述的待测样品为添加有嗜酸乳杆菌的婴幼...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘洋，段文锋，曲勤凤，张清平，俞漪，
申请(专利权)人：上海市质量监督检验技术研究院，
类型：发明
国别省市：上海;31
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