【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及医学免疫诊断领域,具体地指一种D-二聚体免疫胶乳微球制备方法及应用。
技术介绍
D-二聚体是纤维蛋白单体经活化因子XIII交联后,再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物,是一个特异性的纤溶过程标记物。血浆D二聚体测定是了解继发性纤维蛋白溶解功能的一个试验。现有技术采用的胶乳增强免疫比浊法检查原理为:抗D-D单克隆抗体包被于胶乳颗粒上,受体血浆中如果存在D-二聚体,将产生抗原-抗体反应,乳胶颗粒发生聚集现象。1977年Sternberg创建了速率散射比浊法,是以测定的溶液对光的散射程度来判断样品中抗原的含量。一定波长的光沿水平轴照射,碰到小颗粒的免疫复合物可导致光散射,散射强度与抗原抗体免疫复合物的含量成正比。但免疫比浊法由于检测灵敏度达不到临床的要求,于是出现了胶乳增强免疫比浊法。其基本原理是首先将抗体吸附在一种胶乳颗粒上,当遇到相应的抗原时,抗原抗体结合而出现胶乳凝集。单个胶乳颗粒的大小在入射光波长之内,光线可透过。当两个以上胶乳颗粒凝集可阻碍光线透过,使透射光减少,其减少程度与胶乳凝集的程度成正比,亦与抗原成反比。现有技术中常采用聚苯乙烯微球偶联抗体,得到用于检测的胶乳试剂,但偶联效率普遍偏低,只有60~80%,且偶联时碳化二亚胺类活化剂对抗体活性破坏较大,导致产品成品率低。
技术实现思路
本专利技术的目的就是要克服现有D-二聚体免疫胶乳微球制备方法产品成品率低的缺陷,提供一种偶联效率高、偶联后抗体活性影响小的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法及由采用该D-二聚体免疫胶乳微球的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒。为实现上述目的,本专利技术 ...
【技术保护点】
一种D‑二聚体免疫胶乳微球制备方法,步骤如下:1)准备粒径范围200~400nm的聚苯乙烯微球,聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2‑吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4~0.6%w/v,得到pH为5.5~6.5的微球溶液;2)以2‑吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺,得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液;3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计,按每10mg聚苯乙烯微球添加35~45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中,2~8℃震荡活化1h,震荡速度为30~50r/min,得到活化聚苯乙烯微球溶液;4)将浓度≤10mg/mL的DD单克隆抗体在pH8.5~9.5条件下溶解,溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液,使抗体终浓度在0.005~0.02mg/mL之间,得到FDP单抗溶液,储存于2~8℃备用;5)将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中,直至抗体与微球质量比为0.001~0.02:1,整个滴加过程持续4~7min,使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合,两者的混合液呈中性,之后2~8℃震荡12~24h,震荡速度为30~50r/min,即得D‑二聚体免疫胶乳微球。
【技术特征摘要】
1.一种D-二聚体免疫胶乳微球制备方法,步骤如下:1)准备粒径范围200~400nm的聚苯乙烯微球,聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4~0.6%w/v,得到pH为5.5~6.5的微球溶液;2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺,得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液;3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计,按每10mg聚苯乙烯微球添加35~45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中,2~8℃震荡活化1h,震荡速度为30~50r/min,得到活化聚苯乙烯微球溶液;4)将浓度≤10mg/mL的DD单克隆抗体在pH8.5~9.5条件下溶解,溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液,使抗体终浓度在0.005~0.02mg/mL之间,得到FDP单抗溶液,储存于2~8℃备用;5)将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中,直至抗体与微球质量比为0.001~0.02:1,整个滴加过程持续4~7min,使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合,两者的混合液呈中性,之后2~8℃震荡12~24h,震荡速度为30~50r/min,即得D-二聚体免疫胶乳微球。2.根据权利要求1所述的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法,其特征在于:所述步骤3)中震荡活化条件为:4℃震荡活化1h,震荡速度为50r/min。3.根据权利要求1或2所述的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法,其特征在于:所述步骤5)中使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合时,4℃震荡16h,震荡速度为50r/min。4.一种胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒,其特征在于:包括D-二聚体检测试剂R1和D-二聚体检测试剂R2;所述D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为:0.01~13%稳定剂1、10~200mM的缓冲液1、1~6%的促凝剂1、0.02~0.1%的防腐剂1;所述D-二聚体检测试剂R2中各组分及含量为:0.01~23%稳定剂2、1~5mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、10~200mM的缓冲液2、0.02~0.1%的防腐剂2、0.05~5%的赋形剂2;所述D-二聚体检测试剂R2的制备方法为:1)准备粒径范围200~400nm的聚苯乙烯微球,聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4~0.6%w/v,得到pH为5.5~6.5的微球溶液;2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺,得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液,3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计,按每10mg聚苯乙烯微球添加35~45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中,2~8℃震荡活化1h,震荡速度为30~50r/min,得到活化聚苯乙烯微球溶液;4)将浓度≤10mg/mL的DD单克隆抗体在pH8.5~9.5条件下溶解,溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液,使抗体终浓度在0.005~0.02mg/mL之间,得到FDP单抗溶液,储存于2~8℃备用;5)将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中,直至抗体与微球质量比为0.001~0.02:1,整个滴加过程持续4~7min,使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合,两者的混合液呈中性,之后2~8℃震荡12~24h,震荡速度为30~50r/min,即得D-二聚体免疫胶乳微球;6)向D-二聚体免疫胶乳微球中加入含有稳定剂2和缓冲液2的封闭液,震荡得到胶乳溶液;7)胶乳溶液离心,去上清液,以除去其中残留的活化剂,然后加入防腐剂2至贮存浓度,超声分散,即得。5.根据权利要求4所述的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒,其特征在于:所述稳定剂1选自0.5~0.9%的氯化钠、0.1...
【专利技术属性】
技术研发人员:王明,李华中,吴艳芳,
申请(专利权)人:武汉景川诊断技术股份有限公司,
类型:发明
国别省市:湖北;42
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