D-二聚体免疫胶乳微球制备方法及应用技术

技术编号:14412188 阅读:414 留言:0更新日期:2017-01-12 00:09
本发明专利技术公开了一种D‑二聚体免疫胶乳微球制备方法及应用,D‑二聚体免疫胶乳微球制备方法优化化学交联方法,将聚苯乙烯微球的羧基在低pH条件下活化,与高pH条件溶解的抗体上的氨基耦合,两者的混合液呈中性,在低温下偶联12~24h,既保证了抗体的偶联效率,同时极大程度的降低了活化剂对抗体活性的破坏。采用本发明专利技术方法制备的免疫胶乳微球制成的胶乳增强免疫比浊法D‑二聚体测定试剂盒具有灵敏度高、定量准确、重复性好、性质稳定的特点,最低检测低限可达0.01mg/L,可应用于全自动生化分析仪或凝血分析仪,操作快速、简单,从检测至采集结果只需5~10分钟,具有较好的临床应用前景。 1

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及医学免疫诊断领域,具体地指一种D-二聚体免疫胶乳微球制备方法及应用
技术介绍
D-二聚体是纤维蛋白单体经活化因子XIII交联后,再经纤溶酶水解所产生的一种特异性降解产物,是一个特异性的纤溶过程标记物。血浆D二聚体测定是了解继发性纤维蛋白溶解功能的一个试验。现有技术采用的胶乳增强免疫比浊法检查原理为:抗D-D单克隆抗体包被于胶乳颗粒上,受体血浆中如果存在D-二聚体,将产生抗原-抗体反应,乳胶颗粒发生聚集现象。1977年Sternberg创建了速率散射比浊法,是以测定的溶液对光的散射程度来判断样品中抗原的含量。一定波长的光沿水平轴照射,碰到小颗粒的免疫复合物可导致光散射,散射强度与抗原抗体免疫复合物的含量成正比。但免疫比浊法由于检测灵敏度达不到临床的要求,于是出现了胶乳增强免疫比浊法。其基本原理是首先将抗体吸附在一种胶乳颗粒上,当遇到相应的抗原时,抗原抗体结合而出现胶乳凝集。单个胶乳颗粒的大小在入射光波长之内,光线可透过。当两个以上胶乳颗粒凝集可阻碍光线透过,使透射光减少,其减少程度与胶乳凝集的程度成正比,亦与抗原成反比。现有技术中常采用聚苯乙烯微球偶联抗体,得到用于检测的胶乳试剂,但偶联效率普遍偏低,只有60~80%,且偶联时碳化二亚胺类活化剂对抗体活性破坏较大,导致产品成品率低。
技术实现思路
本专利技术的目的就是要克服现有D-二聚体免疫胶乳微球制备方法产品成品率低的缺陷,提供一种偶联效率高、偶联后抗体活性影响小的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法及由采用该D-二聚体免疫胶乳微球的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒。为实现上述目的,本专利技术所提供的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法,步骤如下:1)准备粒径范围200~400nm的聚苯乙烯微球,聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4~0.6%w/v,得到pH为5.5~6.5的微球溶液;2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺,得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液;3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计,按每10mg聚苯乙烯微球添加35~45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中,2~8℃震荡活化1h,震荡速度为30~50r/min,得到活化聚苯乙烯微球溶液;4)将浓度≤10mg/mL的DD单克隆抗体在pH8.5~9.5条件下溶解,溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液,使抗体终浓度在0.005~0.02mg/mL之间,得到FDP单抗溶液,储存于2~8℃备用;5)将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中,直至抗体与微球质量比为0.001~0.02:1,整个滴加过程持续4~7min,使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合,两者的混合液呈中性,之后2~8℃震荡12~24h,震荡速度为30~50r/min,即得D-二聚体免疫胶乳微球。优选地,所述步骤3)中震荡活化条件为:4℃震荡活化1h,震荡速度为50r/min。优选地,所述步骤5)中使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合时,4℃震荡16h,震荡速度为50r/min。本专利技术还提供了一种胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒,包括D-二聚体检测试剂R1和D-二聚体检测试剂R2;所述D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为:0.01~13%稳定剂1、10~200mM的缓冲液1、1~6%的促凝剂1、0.02~0.1%的防腐剂1;所述D-二聚体检测试剂R2中各组分及含量为:0.01~23%稳定剂2、1~5mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、10~200mM的缓冲液2、0.02~0.1%的防腐剂2、0.05~5%的赋形剂2;所述D-二聚体检测试剂R2的制备方法为:1)准备粒径范围200~400nm的聚苯乙烯微球,聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4~0.6%w/v,得到pH为5.5~6.5的微球溶液;2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺,得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液,3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计,按每10mg聚苯乙烯微球添加35~45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中,2~8℃震荡活化1h,震荡速度为30~50r/min,得到活化聚苯乙烯微球溶液;4)将浓度≤10mg/mL的DD单克隆抗体在pH8.5~9.5条件下溶解,溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液,使抗体终浓度在0.005~0.02mg/mL之间,得到FDP单抗溶液,储存于2~8℃备用;5)将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中,直至抗体与微球质量比为0.001~0.02:1,整个滴加过程持续4~7min,使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合,两者的混合液呈中性,之后2~8℃震荡12~24h,震荡速度为30~50r/min,即得D-二聚体免疫胶乳微球;6)向D-二聚体免疫胶乳微球中加入含有稳定剂2和缓冲液2的封闭液,震荡得到胶乳溶液;7)胶乳溶液离心,去上清液,以除去其中残留的活化剂,然后加入防腐剂2至贮存浓度,超声分散,即得。优选地,所述稳定剂1选自0.5~0.9%的氯化钠、0.1~3%的BSA、5~50mM的乙二胺四乙酸二钠、0.01~1%的Tween-20、1~10%的丙三醇中的一种或两种以上;所述缓冲液1选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上;所述促凝剂1选自聚乙二醇6000、聚乙二醇8000或硫酸葡聚糖中的一种;所述防腐剂1选自叠氮钠、Proclin300或硫柳汞中的一种;所述稳定剂2选自0.5~0.9%的氯化钠、0.1~3%的BSA、5~50mM的乙二胺四乙酸二钠、0.01~1%的Tween-20、1~10%的丙三醇中的一种或两种以上;所述缓冲液2选自4-羟乙基哌嗪乙磺酸-氢氧化钠缓冲液、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液、3-(N-吗啉基)-2-羟基丙磺酸-氢氧化钠缓冲液、磷酸盐缓冲液、硼酸盐缓冲液、甘氨酸缓冲液中的一种或两种以上;所述防腐剂2选自叠氮钠、Proclin300或硫柳汞中的一种。所述赋形剂2选自甘露醇、海藻糖、蔗糖或葡萄糖中的一种或两种;进一步优选地,所述D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为:0.4~0.8%的BSA、0.5~0.9%的NaCl、pH7.4的100~200mMTris、0.02~2%的PEG、0.05%的NaN3;所述D-二聚体检测试剂R2中各组分及含量为:0.4~0.8%的BSA、2~6%蔗糖、1~5mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、pH7.4的25~50mmol/L甘氨酸缓冲液、0.05%的NaN3;或所述D-二聚体检测试剂R1和所述D-二聚体检测试剂R2中0.05%的NaN3替换为0.1%的Proclin300。进一步地,上述试剂盒还包括D-二聚体校准品,其各组分及含量为:0.01~13%的校准品稳定剂、20mg/L的D-二聚体、10~200mM的校准品缓冲液、0.02~0.1%的校准品防腐剂、0.05~5%的校准品赋形剂。优选地,所述校准品稳定剂选自0.5~0.9%的氯化钠、0.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种D‑二聚体免疫胶乳微球制备方法,步骤如下:1)准备粒径范围200~400nm的聚苯乙烯微球,聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2‑吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4~0.6%w/v,得到pH为5.5~6.5的微球溶液;2)以2‑吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺,得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液;3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计,按每10mg聚苯乙烯微球添加35~45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中,2~8℃震荡活化1h,震荡速度为30~50r/min,得到活化聚苯乙烯微球溶液;4)将浓度≤10mg/mL的DD单克隆抗体在pH8.5~9.5条件下溶解,溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液,使抗体终浓度在0.005~0.02mg/mL之间,得到FDP单抗溶液,储存于2~8℃备用;5)将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中,直至抗体与微球质量比为0.001~0.02:1,整个滴加过程持续4~7min,使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合,两者的混合液呈中性,之后2~8℃震荡12~24h,震荡速度为30~50r/min,即得D‑二聚体免疫胶乳微球。

【技术特征摘要】
1.一种D-二聚体免疫胶乳微球制备方法,步骤如下:1)准备粒径范围200~400nm的聚苯乙烯微球,聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4~0.6%w/v,得到pH为5.5~6.5的微球溶液;2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺,得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液;3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计,按每10mg聚苯乙烯微球添加35~45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中,2~8℃震荡活化1h,震荡速度为30~50r/min,得到活化聚苯乙烯微球溶液;4)将浓度≤10mg/mL的DD单克隆抗体在pH8.5~9.5条件下溶解,溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液,使抗体终浓度在0.005~0.02mg/mL之间,得到FDP单抗溶液,储存于2~8℃备用;5)将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中,直至抗体与微球质量比为0.001~0.02:1,整个滴加过程持续4~7min,使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合,两者的混合液呈中性,之后2~8℃震荡12~24h,震荡速度为30~50r/min,即得D-二聚体免疫胶乳微球。2.根据权利要求1所述的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法,其特征在于:所述步骤3)中震荡活化条件为:4℃震荡活化1h,震荡速度为50r/min。3.根据权利要求1或2所述的D-二聚体免疫胶乳微球制备方法,其特征在于:所述步骤5)中使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合时,4℃震荡16h,震荡速度为50r/min。4.一种胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒,其特征在于:包括D-二聚体检测试剂R1和D-二聚体检测试剂R2;所述D-二聚体检测试剂R1中各组分及含量为:0.01~13%稳定剂1、10~200mM的缓冲液1、1~6%的促凝剂1、0.02~0.1%的防腐剂1;所述D-二聚体检测试剂R2中各组分及含量为:0.01~23%稳定剂2、1~5mg/ml的D-二聚体免疫胶乳微球、10~200mM的缓冲液2、0.02~0.1%的防腐剂2、0.05~5%的赋形剂2;所述D-二聚体检测试剂R2的制备方法为:1)准备粒径范围200~400nm的聚苯乙烯微球,聚苯乙烯微球首先用浓度为50mmol/L的2-吗啉乙磺酸缓冲液稀释至终浓度0.4~0.6%w/v,得到pH为5.5~6.5的微球溶液;2)以2-吗啉乙磺酸缓冲液溶解碳化二亚胺,得到浓度为10mg/mL的碳化二亚胺溶液,3)以微球溶液中所含聚苯乙烯微球的重量为计,按每10mg聚苯乙烯微球添加35~45μL的比例将碳化二亚胺溶液滴加至微球溶液中,2~8℃震荡活化1h,震荡速度为30~50r/min,得到活化聚苯乙烯微球溶液;4)将浓度≤10mg/mL的DD单克隆抗体在pH8.5~9.5条件下溶解,溶剂是50mmol/L的硼酸盐缓冲液,使抗体终浓度在0.005~0.02mg/mL之间,得到FDP单抗溶液,储存于2~8℃备用;5)将FDP单抗溶液滴加至活化聚苯乙烯微球溶液中,直至抗体与微球质量比为0.001~0.02:1,整个滴加过程持续4~7min,使活化聚苯乙烯微球与抗体上的氨基耦合,两者的混合液呈中性,之后2~8℃震荡12~24h,震荡速度为30~50r/min,即得D-二聚体免疫胶乳微球;6)向D-二聚体免疫胶乳微球中加入含有稳定剂2和缓冲液2的封闭液,震荡得到胶乳溶液;7)胶乳溶液离心,去上清液,以除去其中残留的活化剂,然后加入防腐剂2至贮存浓度,超声分散,即得。5.根据权利要求4所述的胶乳增强免疫比浊法D-二聚体测定试剂盒,其特征在于:所述稳定剂1选自0.5~0.9%的氯化钠、0.1...

【专利技术属性】
技术研发人员:王明李华中吴艳芳
申请(专利权)人:武汉景川诊断技术股份有限公司
类型:发明
国别省市:湖北;42

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