一种桔青霉发酵产核酸酶P1的生产方法技术

本发明专利技术涉及微生物发酵酶制剂领域，具体涉及一种桔青霉发酵产核酸酶P1的生产方法。包括如下步骤：(1)菌种活化；(2)种子制备：按1～2.5％接种量接入种子摇瓶培养基培养；(3)种子罐培养：按0.1～0.5％接种量接入种子罐培养24～28小时，转速50～150rpm，通风比1:0.5～1:1；(4)发酵罐生产：按3～8％接种量接入发酵罐培养100～200小时，转速100～200rpm，通风比1:0.5～1:1.2，其中发酵45～48小时后流加包含氮源、微量元素和碳源的培养基。该法得到核酸酶的酶活水平达3000～4100u/ml，解决了目前核酸酶生产水平低，成本高的问题，具有大规模工业化的价值。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及微生物发酵酶制剂
，具体涉及一种桔青霉发酵产核酸酶P1的生产方法。
技术介绍
核酸酶P1(NucleaseP1)，又名5'-磷酸二酯酶，其作用为水解核酸中的3',5'-磷酸二酯键得到四种5'-核苷酸。核苷酸是生物体内重要的低分子化合物，具有许多生理功能。目前，随着在婴幼儿奶粉及保健品领域的广泛应用，核苷酸市场变的越来越大。其中，核酸酶P1在核苷酸工业化生产中起着至关重要的作用。目前国内研究报道中，核酸酶P1主要通过液体深层发酵得到粗酶液，再由下游处理精制得到成品。液体深层发酵技术已经发展成为一种主流的生产方式，通常采用批次发酵和流加发酵工艺。液体深层发酵技术的关键点在于培养基的优化与工艺控制优化。现有的大量文献报道了核酸酶P1发酵培养基的优化，其中梁新乐等人采用响应面优化方法得到一种培养基，使核酸酶发酵酶活达到1672.6u/ml；李科德以ATCC14994为出发菌株，采用化学和物理诱变育种，获得1株核酸酶高产菌株，并通过单因子和正交试验对该菌株的产酶发酵条件进行了优化。在优化条件下，该菌种的产酶水平达到1329u/ml。李兆飞等通过氯化锂和离子注入等诱变方式筛选得到一株高产菌种，发酵酶活可以达到1166u/ml，以上文献报道的发酵水平为目前较高发酵水平。工艺控制优化方面，已有报道采用小型发酵罐进行小试实验，通过溶氧、pH、搅拌等参数控制，将摇瓶发酵水平放大，但此类文献多集中于发酵过程机理的研究，梁剑光等通过发酵罐控制使发酵酶活达到400u/ml。现有规模发酵水平最高达到1180u/ml。此外，已有相关专利报道采用基因工程菌毕赤酵母表达发酵制备核酸酶P1。上述现有技术的引证文件分别为：梁新乐，黄莹莹，张虹，等.响应面法优化桔青霉F-5-5核酸酶P1发酵培养基碳氮源[J].核农学报，2011,25(1):0057～0061.李科德，韩木兰，柏建玲，等.5'-磷酸二酯酶高产菌株的选育和发酵培养条件的优化[J].微生物学杂志，2001,21(3):28～30.李兆飞，姚鹃，余华顺，等.氯化锂-离子束复合诱变核酸酶P1高产菌株研究.[J].食品科技，2013,38(12):8.
技术实现思路
本专利技术解决的技术问题是现有的采用桔青霉发酵生产核酸酶P1的方法存在生产成本高、核酸酶P1的酶活力低，因而产量低的缺陷。为了解决上述技术问题，本专利技术提供一种桔青霉发酵产核酸酶P1的生产方法。具体来说，本专利技术是通过下述技术方案解决技术问题的：本专利技术提供了一种桔青霉发酵产核酸酶P1的生产方法，包括如下步骤：(1)菌种活化：将桔青霉孢子接入培养基中培养，洗脱得到孢子悬液；(2)种子制备：将孢子悬液按照1％～2.5％重量比的接种量接入种子摇瓶培养基中，置于28～29℃培养20～22小时，得到种子菌液；(3)种子罐培养：按照0.1％～0.5％重量比的接种量，将种子菌液接入装有种子培养基的种子罐中，培养温度29～30℃，转速50～150rpm，通风比1:0.5～1:1，培养周期为24～28小时，得到种子培养液；以及(4)发酵罐生产：按照3％～8％重量比的接种量，将种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度29～30℃，转速100～200rpm，通风比1:0.5～1:1.2，发酵周期为100～200小时；其中期间，发酵45～48小时后开始流加包含氮源、微量元素和碳源的培养基，直至发酵结束。优选的，步骤(1)中，桔青霉孢子接入PDA培养基，置于28～29℃环境中培养2～3天。优选的，步骤(4)中，所述氮源包括蛋白胨，所述微量元素包括硫酸锌。优选的，所述蛋白胨的浓度为10～30％(w/v)，所述硫酸锌的浓度为0.1～2％(w/v)。优选的，所述蛋白胨的浓度为10～25％(w/v)，所述硫酸锌的浓度为0.4～1.4％(w/v)。优选的，所述蛋白胨的浓度为20％(w/v)；所述硫酸锌的浓度为1.2％(w/v)。优选的，步骤(4)中，包含所述氮源和微量元素的培养基的流加速率为0.01～0.04吨/小时。优选的，所述碳源包括蔗糖或者葡萄糖。优选的，所述蔗糖的浓度为10～50％(w/v)，所述葡萄糖的浓度为10～30％(w/v)。优选的，所述蔗糖的浓度为20～40％(w/v)，所述葡萄糖的浓度为20～30％(w/v)。优选的，所述蔗糖的浓度为35％(w/v)；所述葡萄糖的浓度为25％(w/v)。优选的，包含所述碳源的培养基的流加速率为0.01～0.05吨/小时。优选的，步骤(3)中，所述的种子培养基，以100mL水计，包括：葡萄糖1～6g，蛋白胨0.2～1g，磷酸二氢钾0.01～0.08g，磷酸氢二钾0.01～0.08g，氯化钙0.02～0.1g和硫酸镁0.02～0.1g。优选的，步骤(4)中，所述的发酵培养基，以100mL水计，包括：蔗糖1～6g，蛋白胨0.2～1g，磷酸二氢钾0.05g，磷酸氢二钾0.01～0.08g，氯化钙0.08g，硫酸镁0.02～0.1g，硫酸锌0.01～0.08g，麸皮0.1～1g和玉米浆0.1～0.6g。优选的，对步骤(4)得到的发酵后的菌液采用板框进行过滤，得到粗酶过滤液。优选的，对所述的粗酶过滤液进行浓缩，浓缩倍数10～20倍，得到浓缩液。优选的，对所述的浓缩液冻干或喷粉处理得到固体核酸酶。其中，包含所述碳源的培养基指的是不含氮源和微量元素，仅以碳源作为主要成分的培养基。其中，包含所述氮源和微量元素的培养基指的是不含碳源，仅以氮源和微量元素作为主要成分的培养基。其中，步骤(1)中所述桔青霉菌株(Penicilliumcitrinum)，商购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，菌株保藏编号为CGMCC3.3174，其保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。其中，通风比用每分钟内通过单位体积培养液的空气体积比来表示。(V/V.min)。本专利技术的有益效果是：本专利技术通过该生产方法，解决了目前核酸酶P1生产水平低，生产成本高的问题，从而提高了产量，实现了工业化生产。核酸酶P1的主要应用为水解核糖核酸得到核苷酸，而由核苷酸作为食品、调味品、药品、营养品的需求越来越大，因此核酸酶P1作为重要的酶制剂对整个核苷酸工业起着重要的作用。目前国内规模化生产核酸酶的企业匮乏，现有的文献报道与专利技术也很少有工业化生产，市面上核酸酶商品较少。国外生产厂商为日本天野酶制剂，其生产的核酸酶在全球处于垄断地位。本专利技术通过对桔青霉发酵工艺的改进与优化，为核酸酶的工业化生产提供了条件，将有力的改变核酸酶的市场格局。具体实施方式本专利技术为了克服现有技术中采用桔青霉发酵法生产核酸酶P1的方法存在生产成本高、核酸酶P1的酶活力低，因而产量低的缺陷，通过改进桔青霉液态发酵方法制备得到核酸酶成品，可用于核糖核酸的水解。具体地，在一种优选实施方式中，本专利技术通过如下步骤发酵制备核酸酶P1，包括如下步骤：(1)菌种活化：将桔青霉孢子接入培养基中培养，洗脱得到孢子悬液；(2)种子制备：将孢子悬液按照1％～2.5％重量比的接种量接入种子摇瓶培养基中，置于28～29℃培养20～22小时，得到种子菌液；(3)种子罐培养：按照0.1％～本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种桔青霉发酵产核酸酶P1的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菌种活化：将桔青霉孢子接入培养基中培养，洗脱得到孢子悬液；(2)种子制备：将孢子悬液按照1％～2.5％重量比的接种量接入种子摇瓶培养基中，置于28～29℃培养20～22小时，得到种子菌液；(3)种子罐培养：按照0.1％～0.5％重量比的接种量，将种子菌液接入装有种子培养基的种子罐中，培养温度29～30℃，转速50～150rpm，通风比1:0.5～1:1，培养周期为24～28小时，得到种子培养液；以及(4)发酵罐生产：按照3％～8％重量比的接种量，将种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度29～30℃，转速100～200rpm，通风比1:0.5～1:1.2，发酵周期为100～200小时；其中期间，发酵45～48小时后开始流加包含氮源、微量元素和碳源的培养基，直至发酵结束。

【技术特征摘要】
1.一种桔青霉发酵产核酸酶P1的生产方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)菌种活化：将桔青霉孢子接入培养基中培养，洗脱得到孢子悬液；(2)种子制备：将孢子悬液按照1％～2.5％重量比的接种量接入种子摇瓶培养基中，置于28～29℃培养20～22小时，得到种子菌液；(3)种子罐培养：按照0.1％～0.5％重量比的接种量，将种子菌液接入装有种子培养基的种子罐中，培养温度29～30℃，转速50～150rpm，通风比1:0.5～1:1，培养周期为24～28小时，得到种子培养液；以及(4)发酵罐生产：按照3％～8％重量比的接种量，将种子培养液接入装有发酵培养基的发酵罐中，培养温度29～30℃，转速100～200rpm，通风比1:0.5～1:1.2，发酵周期为100～200小时；其中期间，发酵45～48小时后开始流加包含氮源、微量元素和碳源的培养基，直至发酵结束。2.根据权利要求1所述的生产方法，其特征在于，步骤(1)中，桔青霉孢子接入PDA培养基，置于28～29℃环境中培养2～3天。3.根据权利要求1-2任一所述的生产方法，其特征在于，步骤(4)中，所述氮源包括蛋白胨，所述微量元素包括硫酸锌。4.根据权利要求3所述的生产方法，其特征在于，所述蛋白胨的浓度为10～30％(w/v)，优选为10～25％(w/v)；所述硫酸锌的浓度为0.1～2％(w/v)，优选为0.4～1.4％(w/v)。5.根据权利要求3或4所述的生产方法，其特征在于，所述蛋白胨的浓度为20％(w/...

【专利技术属性】
技术研发人员：喻晨，俞学锋，李知洪，姚鹃，吴尧，董先有，李汉文，余华顺，
申请(专利权)人：安琪酵母股份有限公司，
类型：发明
国别省市：湖北;42