本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体地，本发明专利技术涉及一种基于化学偶联的壳寡糖疫苗佐剂及其应用。本发明专利技术的壳寡糖疫苗佐剂包括巯基化壳寡糖与异型双功能连接剂，巯基化壳寡糖通过异型双功能连接剂与疫苗偶联。本发明专利技术的壳寡糖佐剂能够增强免疫应答，具有良好的佐剂作用，可以用作减毒疫苗、蛋白质疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗的佐剂。本发明专利技术中的壳寡糖已经可以大规模生产，制备方法成熟稳定。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药
，具体地，本专利技术涉及一种基于化学偶联的壳寡糖疫苗佐剂及其应用。
技术介绍
猪圆环病毒2型(Porcinecircovirustype2，PCV2)是引起断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原，临床上常与猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪口蹄疫病毒及猪细小病毒等混合感染。同时，PCV2还与猪皮炎与肾病综合征、猪呼吸道疾病综合征、母猪繁殖障碍、仔猪先天性震颤、坏死性淋巴结炎、肉芽肿性肠炎及渗出性表皮炎等疾病密切相关，这些与PCV2相关的疾病统称为猪圆环病毒病(Expertreviewofvaccines,2015,14:473-487)。我国在2000年首次发现该病，针对猪群的流行病学调查显示，PCV2抗体阳性率高达80％以上，而被调查的猪场阳性率达100％，给养猪业造成了重大的经济损失(动物医学进展,2014,35:111-115)。目前，对于PCV2造成的猪圆环病毒病尚无有效的治疗措施，防控该病的主要手段是采用疫苗免疫。国际上已经商品化的猪圆环病毒疫苗有5种，国内34种，主要分为灭活疫苗、亚单位疫苗及PCVl-PCV2嵌合型疫苗三个种类。这些疫苗能够有效减轻PCV2感染引起的临床症状，显著降低病毒血症、系统性疾病和病毒排泄，对猪圆环病毒病的防控起到了关键作用，但是仍不能完全阻止PCV2的感染和传播。目前商用猪圆环病毒疫苗基本使用矿物油作为佐剂，主要包括水包油(O/W)、油包水(W/O)、水包油包水(W/O/W)三种剂型。油佐剂疫苗在抗体效价和免疫持久性方面都优于铝盐佐剂疫苗，但油佐剂不良反应严重，皮下注射会引起发热、炎症、溃疡和肉芽肿。这些油类长期潴留于组织中不被代谢，严重影响肉产品质量(中国家禽,2013,35:44-46)。因此，很有必要研究开发新型安全高效疫苗佐剂，更好的克服现有猪圆环病毒疫苗在免疫原性和保护效力方面的不足，并替代现有的矿物油佐剂，以辅助包括猪圆环病毒病疫苗在内的多种疫苗发挥其最大的传染病防控效用。近年来研究发现多糖具有免疫佐剂的作用，能增强疫苗的免疫效果，促进机体特异型免疫与非特异型免疫。而将多糖降解制备的功能性寡糖用作疫苗佐剂的研究也应运而生。壳寡糖(Chitooligosaccharides，COS)是氨基葡萄糖通过β-1,4-糖苷键连接而成的小分子寡糖，可经化学或酶降解甲壳素工艺制得。壳寡糖对人类健康的影响表现在具有抗氧化作用，有抗菌，具有抗炎、促进伤口愈合作用，有助于关节健康、心脏血管健康，抑制糖尿病，抗癌、抗肿瘤和抗突变作用，免疫调节作用，具有抗病毒作用，减肥功效，同时能增强记忆和改善大脑健康(杜昱光.壳寡糖的功能研究及应用.化学工业出版社[M],北京,2009)。壳寡糖分子量低、水溶性好，具有良好的生物相容性，并且其来源广泛、纯天然、易吸收，更为值得关注的是它能够有效激活机体细胞免疫和体液免疫，将其开发为疫苗佐剂具有良好的应用前景。Liu等将壳寡糖作为福尔马林灭活鳗弧菌疫苗的佐剂，能明显促进机体的体液免疫，有效的抑制病原菌的侵袭，免疫效果与商用佐剂ISA763A相当，进一步明确了壳寡糖的佐剂活性(Fish&shellfishimmunology,2015,47:855-860)。目前，佐剂最常用的使用方法是与抗原直接物理混合，然后免疫被保护者。简单的物理混合虽然能发挥免疫佐剂活性，但并不一定是发挥其佐剂活性的最佳方式。文献报道，将抗原和佐剂共存于一个递送系统中能增强免疫原性，如抗原和佐剂活性的鞭毛蛋白、CpG及LPS等(Vaccine,2009,27:4784-4790；BioconjugateChem,2007,18:77-83；Vaccine,2009,27:3013-3021)。研究显示，只有当抗原递呈细胞(APC)呈递一定量的抗原和佐剂才能激活T细胞，只呈递其一并不能激活T细胞(Nature,2006,440:808-812；Vaccine,2008,26:1626-1637)。因此，将佐剂和抗原化学偶联成一个整体使之到达相同的APC是增强抗原免疫原性的好策略。Slütter等将OVA抗原和佐剂三甲基壳聚糖(TMC)共价键结合后，能明显的增强OVA的免疫原性，产生的IgG抗体滴度是OVA、OVA和TMC物理混合的1000倍，并能有效的刺激树突细胞成熟，促进抗原呈递作用(JournalofControlledRelease,2010,143:207-214)。另有研究显示新型佐剂TLR7激动剂与抗原化学结合后，能明显提高免疫反应，并对肺部感染的小鼠模型具有良好的保护作用(EuropeanJournalofPharmaceuticsandBiopharmaceutics,2014,87:310-317)。
技术实现思路
本专利技术的主要目的之一在于提供一种基于化学偶联的新型壳寡糖疫苗佐剂及应用；本专利技术的主要目的之二在于提供基于新型壳寡糖佐剂的疫苗制剂的制备方法。为实现上述目的，具体地，本专利技术包括以下几个方面：本专利技术提供的一种基于化学偶联的壳寡糖疫苗佐剂，包括巯基化壳寡糖与异型双功能连接剂，巯基化壳寡糖通过异型双功能连接剂与疫苗偶联。根据本专利技术的壳寡糖疫苗佐剂，其中，所述巯基化壳寡糖通过活化剂活化壳寡糖(COS)获得巯基化壳寡糖，所述活化剂可以为2-亚氨基硫烷盐酸盐(IT)、巯基乙酸、3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯等，所述异型双功能连接剂为3-苯甲酰马来酰亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺(MBS)、3-马来酰亚胺基丙酸、3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯、4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯等。本专利技术还公开了用异型双功能连接剂，即两端含有不同功能团的试剂，来制备壳寡糖偶联物的方法。根据本专利技术的壳寡糖疫苗佐剂，其特征在于，所述巯基化壳寡糖与异型双功能连接剂的重量比为0.1:1-0.8:1。本专利技术还提供了一种疫苗制剂，所述疫苗制剂包括本专利技术上述任一壳寡糖疫苗佐剂与疫苗，所述壳寡糖疫苗佐剂通过异型双功能连接剂与疫苗的抗原偶联。根据本专利技术的疫苗制剂，其中，所述壳寡糖疫苗佐剂与疫苗的重量比为0.3:1-0.6:1。根据本专利技术的疫苗制剂，其中，所述疫苗为减毒活疫苗、蛋白质疫苗、多糖疫苗、核酸疫苗或多肽疫苗。根据本专利技术的疫苗制剂，其中，所述的疫苗为猪圆环灭活疫苗，还适合于猪蓝耳病疫苗、鸡新城疫疫苗及多糖结合疫苗等其它疫苗。本专利技术还提供一种上述任一所述疫苗制剂的制备方法，包括以下步骤：1)将壳寡糖巯基化，获得巯基化壳寡糖；所述巯基化使用的活化剂与壳寡糖的重量比为0.1:1-0.5:1；2)将异型双功能连接剂与疫苗混合反应，获得疫苗衍生化学物；所述异型双功能连接剂与疫苗的重量比为0.1:1-0.8:1；3)将巯基化壳寡糖与疫苗衍生化学物混合反应，获得偶联物；所述巯基化壳寡糖与疫苗衍生化学物的重量比为5:1-1:1；4)将步骤3)所得偶联物纯化除菌，制得疫苗制剂。本专利技术还提供了所述疫苗佐剂在疫苗生产中的应用。本专利技术涉及的偶联物纯化优选凝胶层析，所用填料可以选择葡聚糖凝胶(Sephadex)、琼脂糖凝胶(Sepharose)和丙烯葡聚糖凝胶(Sephacryl)中的一种。偶联物纯化也可以采用离子交换层析或疏水层析。本发本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种基于化学偶联的壳寡糖疫苗佐剂，其特征在于，所述壳寡糖疫苗佐剂包括巯基化壳寡糖与异型双功能连接剂，巯基化壳寡糖通过异型双功能连接剂与疫苗偶联。
【技术特征摘要】
1.一种基于化学偶联的壳寡糖疫苗佐剂，其特征在于，所述壳寡糖疫苗佐剂包括巯基化壳寡糖与异型双功能连接剂，巯基化壳寡糖通过异型双功能连接剂与疫苗偶联。2.根据权利要求1所述的壳寡糖疫苗佐剂，其特征在于，所述巯基化壳寡糖通过活化剂活化壳寡糖获得巯基化壳寡糖，所述活化剂为2-亚氨基硫烷盐酸盐、巯基乙酸或3-(2-吡啶二巯基)丙酸N-羟基琥珀酰亚胺酯；所述异型双功能连接剂为3-苯甲酰马来酰亚胺-N-羟基琥珀酰亚胺、3-马来酰亚胺基丙酸、3-马来酰亚胺基丙酸羟基琥珀酰亚胺酯或4-(N-马来酰亚胺基甲基)环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯。3.根据权利要求1或2所述的壳寡糖疫苗佐剂，其特征在于，所述巯基化壳寡糖与异型双功能连接剂的重量比为0.1:1-0.8:1。4.一种疫苗制剂，其特征在于，所述疫苗制剂包括权利要求1-3任一所述壳...
【专利技术属性】
技术研发人员：杜昱光，张贵强，胡涛，贾培媛，刘洪涛，
申请(专利权)人：中国科学院过程工程研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11
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