一种血小板环境扫描电镜观察样本的改良制备方法技术

本发明专利技术公开了一种通过在现有技术上改进的制备血小板环境扫描电镜观察样本的方法，涉及生物医学技术领域，具体地说是一种血小板环境扫描电镜观察样本的改良制备方法。其特征是：该方法的制作步骤，离心、分离富含血小板的血浆0.5ml，预固定；再离心15min后弃上清液，再固定2h～4h；锇酸缓冲液固定，乙醇系列脱水；对半切开锥形离心管，再横切，留锥形管底部，二氧化碳置换，干燥处理，真空镀膜。环境扫描电子显微镜在真空条件下，扫描观察切留锥形管底部的血小板，拍摄照片。本发明专利技术提供一种血小板环境扫描电镜观察样本的改良制备方法，环境扫描电子显微镜下观察血小板的完整性好，防止标本因素而损伤电子显微镜，提高了观察质量。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种生物医学
，具体地说是一种血小板环境扫描电镜观察样本的改良制备方法。
技术介绍
血小板(bloodplatelet)是人血液中三种有形成分(红细胞、白细胞、血小板)之一，血小板是骨髓中巨核细胞质脱落下来的小块，表面有完整的细胞膜，无细胞核，血小板体积小，直经为2微米～4微米。血小板在止血、伤口愈合、炎症反应、血栓形成及器官移植排斥等生理和病理过程中有重要作用。环境扫描电子显微镜，是一种扫描式电子光学仪器，可以对微小样品进行形态观察。普通扫描电镜的样品室和镜筒内均为高真空(约为10-6个大气压)，只能检验导电导热或经导电处理的干燥固体样品。现有技术的血小板环境扫描电镜观察样本的制备方法，硅化处理试管、吸管，采静脉血2ml注入抗凝试管，在4℃低温下，标本经1000r/min离心10min，分离富含血小板的血浆0.5ml，移至锥形离心管中，0.2％戊二醛0.5ml预固定；预固定后血浆在低温下，标本经4000r/min离心15min，弃去上清液，加3％戊二醛固定液1ml，使沉淀的血小板固定2h～4h。1.5％戊二醛缓冲液吹散血小板，锇酸缓冲液固定，乙醇系列脱水，醋酸戊酯5min，将细胞充分散开，细胞悬浮液制片，二氧化碳置换，干燥，真空镀膜；用环境扫描电镜真空下，对血小板进行扫描观察，拍摄照片；环境扫描电镜观察，发现血小板易于破损，难以完成观察超微结构，而且该种样本在环境扫描电镜真空条件下观察时，常常因为血小板的细胞碎粒飞起，损伤电子显微镜。血小板可能参与多种疾病的发病机制，由于血小板的分离和制作工艺上存在困难，现有制备技术未能很好解决环境扫描电子显微镜观察血小板未活化与活化时的表面超微结构的变化，本专利技术解决了上述血小板破损与易于损伤电镜这两个难题。本专利技术所要解决的技术问题是克服现有血小板环境扫描电镜观察样本制备工艺上的缺点，提供一种从血液样本中有效分离血小板，制作血小板环境扫描电镜观察样本的改良技术方法，电子显微镜下观察血小板的细胞完整性好，不会因为标本的因素而损伤电子显微镜，保证血小板超微结构环境扫描电镜观察方法的有效性。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种从血液样本中有效分离血小板，制作血小板环境扫描电镜观察样本的改良方法，保证血小板超微结构环境扫描电镜观察方法的有效性。本专利技术采用的技术方案是，一种血小板环境扫描电镜观察样本的改良制备方法，其特征在于，所述制作步骤：硅化处理试管、吸管；采静脉血2ml注入抗凝试管；在4℃低温下，标本经1000r/min离心10min，分离富含血小板的血浆0.5ml，移至锥形离心管中，0.2％戊二醛0.5ml预固定；预固定后的血浆在低温下，标本经4000r/min离心15min，弃去上清液，加3％戊二醛固定液1ml，使沉淀的血小板固定2h～4h；弃去3％戊二醛固定液，锇酸缓冲液固定，乙醇系列脱水；对半切开锥形离心管，再横切，留锥形管底部，二氧化碳置换，干燥处理锥形管底部的血小板样本，切留锥形管底部置镜物台固定，真空镀膜；用环境扫描电子显微镜在真空条件下，对切留锥形管底部的血小板进行扫描观察，拍摄照片。进一步地说，所述制作步骤：(1)硅化处理试管、吸管，采静脉血2ml注入抗凝试管；(2)在4℃低温下，标本经1000r/min离心10min，分离富含血小板的血浆0.5ml，移至锥形离心管中，0.2％戊二醛0.5ml预固定；(3)预固定后的血浆在低温下，标本经4000r/min离心15min，弃去上清液，加3％戊二醛固定液1ml，使沉淀的血小板固定2h～4h；(4)弃去3％戊二醛固定液，锇酸缓冲液固定，乙醇系列脱水；(5)对半切开锥形离心管，再横切，留锥形管底部，二氧化碳置换，干燥处理锥形管底部的血小板样本；(6)切留锥形管底部置镜物台固定，真空镀膜；(7)用环境扫描电子显微镜在真空条件下，对切留锥形管底部的血小板进行扫描观察，拍摄照片。附图说明图1为本实施例未活化的血小板放大20000倍的环境扫描电镜照片，可见血小板表面正常超微结构，血小板表面圆滑。图2为本实施例活化的血小板放大20000倍的环境扫描电镜照片，可见血小板表面超微结构变化，血小板体积增大、表面突起和皱折增多，多个伪足突出。附图标记说明：1-未活化血小板的胞体，2-放大倍数比例尺(1μm)，3-活化血小板的胞体，4-活化的血小板表面突起的多个伪足。具体实施方式本专利技术结合以下实施例作进一步描述：实施例1，一种血小板环境扫描电镜观察样本的改良制备方法，其特征在于，所述制作步骤：硅化处理试管、吸管；采静脉血2ml注入抗凝试管；在4℃低温下，标本经1000r/min离心10min，分离富含血小板的血浆0.5ml，移至锥形离心管中，0.2％戊二醛0.5ml预固定；预固定后的血浆在低温下，标本经4000r/min离心15min，弃去上清液，加3％戊二醛固定液1ml，使沉淀的血小板固定2h～4h；弃去3％戊二醛固定液，锇酸缓冲液固定，乙醇系列脱水；对半切开锥形离心管，再横切，留锥形管底部，二氧化碳置换，干燥处理锥形管底部的血小板样本，切留锥形管底部置镜物台固定，真空镀膜；用环境扫描电子显微镜在真空条件下，对切留锥形管底部的血小板进行扫描观察，拍摄照片。进一步地说，所述制作步骤：(1)硅化处理试管、吸管，采静脉血2ml注入抗凝试管；(2)在4℃低温下，标本经1000r/min离心10min，分离富含血小板的血浆0.5ml，移至锥形离心管中，0.2％戊二醛0.5ml预固定；(3)血浆在低温下，标本经4000r/min离心15min，弃去上清液，加3％戊二醛固定液1ml，使沉淀的血小板固定2h～4h；(4)弃去3％戊二醛固定液，锇酸缓冲液固定，乙醇系列脱水；(5)对半切开锥形离心管，再横切，留锥形管底部，二氧化碳置换，干燥处理锥形管底部的血小板样本；(6)切留锥形管的底部置镜物台固定，真空镀膜；(7)用环境扫描电子显微镜在真空条件下，对切留锥形管底部的血小板进行扫描观察，拍摄照片。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血小板环境扫描电镜观察样本的改良制备方法，其特征在于，所述制作步骤，经过预固定、缓冲液固定、脱水的血小板样本，对半切开锥形离心管，再横切，留锥形管底部，二氧化碳置换，干燥处理锥形管底部的血小板样本，镜物台固定，真空镀膜。

【技术特征摘要】
1.一种血小板环境扫描电镜观察样本的改良制备方法，其特征在于，所述制作步骤，经过预固定、缓冲液固定、脱水的血小板样本，对半切开锥形离心管，再横切，留锥形管底部，二氧化碳置换，干燥处理锥形管底部的血小板样本...

【专利技术属性】
技术研发人员：诸葛毅，俎德玲，
申请(专利权)人：衢州职业技术学院，
类型：发明
国别省市：浙江;33