本发明专利技术属于寄生虫病的生物光学标记领域，主要为一种近红外荧光染料的合成，并将其应用于血吸虫成虫荧光标记。一种近红外荧光染料，具有共轭二烯键结构，更具体的是分子结构通过三个烯键链接，亲水基团具有磺酸基(‑SO3H)和羧基(‑COOH)；并且这种近红外荧光染料可以用于血吸虫成虫荧光标记成像。实现了近红外荧光染料的设计、合成以及荧光标记血吸虫成虫。近红外荧光染料通过共轭体系使荧光染料发射光位于近红外区域，再结合亲水性的磺酸基和羧基进行水溶性改性，该类近红外荧光染料用于荧光标记血吸虫成虫，有效地解决了血吸虫成虫荧光成像中荧光染色效果差、背景荧光干扰和光穿透性差的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于寄生虫病防治的生物光学标记领域，具体来说，本专利技术涉及一种近红外有机荧光染料的合成及其应用于血吸虫成虫的荧光标记，本专利技术为血吸虫成虫荧光标记提供了一种新颖的方法，该近红外荧光染料对血吸虫成虫具有优良的荧光标记效果。技术背景血吸虫病是一种盛行于热带和亚热带地区、对人民身体健康有严重危害并影响社会经济发展的传染病，被世界卫生组织(WHO)列为极易复现的再现传染病。血吸虫病流行于74个国家和地区，全世界目前约有6.52亿人口受威胁，有1.93亿感染者，有症状病例约1.2亿，其中2000万为严重病例，我国是血吸虫病的主要流行区。血吸虫病是一种典型的经水源传播的人兽共患寄生虫病，其生活史可分为卵、毛蚴、母胞蚴、子胞蚴、尾蚴、童虫和成虫等7个主要阶段。血吸虫尾蚴进入人体之后，发育为童虫阶段，再通过30天左右成长为成虫，成虫对人体造成极大的伤害，引发肝脾肿大、肝硬化等，晚期严重者可以致人死亡。目前已研制出了对吸虫成虫有良好杀灭效果的药物(例如吡喹酮)，但由于抗血吸虫药物的长期广泛大量使用，血吸虫已经对其产生耐药性。同时该类药物灭杀成虫的实际作用机理尚不明确，所以还需要对抗血吸虫药物进行深入的研究。但是传统的研究方法(主要为对死亡虫体的检测)来研究药物对成虫的可能作用机理，并不能准确、直接地反映出药物在活体上的作用方式和位点，影响研究结果的准确性和可信度，因此需要寻求新的研究方法来探索其作用机制。目前，荧光成像是一项灵敏的、非侵入式、费用低廉的可视化检测技术，其分辨率可达百纳米，可实现从细胞到生物体的活体成像。荧光成像技术具有监测灵敏、成像迅速、可同时观测多分子事件等优点，因此在抗血吸虫药物作用机理研究方面具有广泛的应用前景。荧光成像用于血吸虫研究方面，AndreaB.Kohn等采用4,5-diaminoXuorescein-2荧光探针检测血吸虫体内一氧化氮的含量，研究结果发现虫体一氧化氮的释放依赖于一氧化氮合酶(NOS)，表明一氧化氮酶在血吸虫的生理上起着重要的作用。SATOH.等应用荧光成像的方法观察曼氏血吸虫成虫的排泄系统。应用荧光探针试卤灵(resorufin)观察虫体排泄系统的作用模式，其研究结果将有助于了解曼氏血吸虫原肾系的生理功能。上述使用传统有机荧光染料作为荧光探针对血吸虫成虫进行研究，存在以下的缺点：(1)短波长激发与发射存在生物自发背景荧光干扰。(2)大部分的荧光探针光稳定性差，导致不能长时间荧光观察。(3)大部分有机小分子荧光染料亲水性差，限制了其生物应用。同时，血吸虫成虫结构具有以下特征：(1)血吸虫成虫体壁由体被、基膜及体被下层构成，并通过胞质小管与体被相连，使体被下层被表层无核无细胞分隔的体被所覆盖。(2)血吸虫成虫寄生于哺乳动物血管中，体表与宿主血液直接接触，为了逃避宿主的免疫性攻击，体被覆盖了一种与宿主红细胞ab抗原相同的特异性糖类，成虫体表呈现较强的亲水性。(3)血吸虫成虫个体较大，对荧光的穿透性要求较高。鉴于目前荧光染料的不足和血吸虫成虫的生理结构特征之间的矛盾，所以开发出对血吸虫成虫具有良好荧光标记效果的荧光染料是一项挑战。本专利技术结合近红外荧光染料的优势，如生物体极少在近红外光谱区有自发荧光，使得近红外荧光染料成像受背景荧光干扰很小；其次，因散射光强度与波长的四次方成反比，发射光位于长波区的近红外荧光染料受其干扰小，对生物组织穿透能力强且损伤小。因此，专利技术人综合考虑了荧光染料的激发和发射范围、水溶性、血吸虫生理特征等因数，借助近红外荧光染料作为荧光探针应用于血吸虫成虫的荧光标记，成功地解决了血吸虫成虫荧光成像过程中荧光染色效果差、背景荧光干扰大和荧光穿透性差的问题。
技术实现思路
本专利技术提供了一种近红外荧光染料，使其具有对血吸虫成虫进行荧光标记的性能，可作为血吸虫成虫荧光标记试剂。本专利技术的近红外荧光染料具体的结构如下：本专利技术化合物可按照如下合成路线制备：制备本专利技术化合物的原料和所用试剂均为已知化合物，可以在市场上获得，或可用本领域已知的方法制备。化合物1,1,2-三甲基-1H-苯并吲哚(1.0-2.0mmol)与3-溴丙酸(1.2-2.4mmol)在甲苯中110℃加热24小时可得到产物M-1。所得中间产物M-1(1.0-2.0mmol)与N,N’-二苯基甲脒(10-2.0mmol)在乙酸酐的溶液中110℃加热2小时得到产物M-2。产物M-2(1.0-2.0mmol)与3-(3-磺酸基-丙基)-1,1,2-三甲基-1H-苯并吲哚(1.0-2.0mmol)在醋酸钾与乙酸酐的混合溶液中70℃加热反应2小时，合成目标荧光染料NIR-COOH-SO3H。上述荧光染料作为血吸虫成虫荧光标记探针，荧光标记方法包括如下步骤：(1)获取血吸虫尾蚴：尾蚴从感染毛蚴的阳性的钉螺得到，取阳性螺放入清水中，在白炽灯下光照2小时左右逸出新鲜尾蚴。(2)小鼠感染：将六周龄雌性小鼠剪去小鼠腹部体毛，取温水湿润小鼠腹部皮肤，并将含有50条左右尾蚴的盖玻片贴于小鼠去毛的腹部皮肤上，保持20分钟使尾蚴穿透小鼠皮肤进行感染。(3)获取血吸虫成虫：将感染后的小鼠饲养6周后，使其颈部脱臼致死，严格按照无菌操作要求，依次剖开腹部皮肤、腹膜，采取灌注法于肝门-肠系膜静脉中收集成虫。将收集到的成虫在生理盐水中漂洗3次后分配到培养皿中，加入RPMI-1640(RoswellParkMemorialInstitute)细胞培养液培养2小时后，镜检筛选活性良好的虫体用于荧光成像。(4)血吸虫成虫荧光成像：荧光染料用二甲基亚砜(DMSO)溶解准确配制成1mmol的母液，然后再用PBS缓冲液稀释成5μM的稀释液。移取200μL稀释液加入到培养皿中，用镊子挑取成虫加入到荧光染料稀释液中，于室温孵育5分钟至6小时后，将成虫转移到荧光成像器皿，在635nm激发下共聚焦荧光显微镜观察成虫的荧光标记情况，采集650-750nm的荧光信号进行荧光成像。专利技术人通过设计与合成，将近红外有机荧光染料用于血吸虫成虫荧光标记的研究，可以成功地解决成虫荧光成像过程中荧光标记效果差、背景荧光干扰大和光穿透性差的不足。附图说明图1荧光染料NIR-COOH-SO3H的吸收光谱和荧光发射光谱图2荧光染料NIR-COOH-SO3H细胞激光共聚焦荧光成像图图3荧光染料NIR-COOH-SO3H标记日本血吸虫成虫的激光共聚焦荧光成像图图4荧光染料NIR-COOH-SO3H标记日本血吸虫成虫头器的激光共聚焦荧光成像图图5荧光染料NIR-COOH-SO3H标记日本血吸虫荧光成像的信噪比图具体实施方式下文给出了本专利技术化合物的具体实施例，它们用实例详细说明本专利技术，但对本专利技术不构成任何限制。本实施例中所用的原料均为已知化合物，可以由商业途径获得，或可按相关文献设计方法合成。在下述实施例中，所涉及的理化参数由下述仪器测定的：1HNMR谱在BrukerMercuryplus上采用400MHz测定，用TMS为内标；质谱数据MALDI-TOF-MS在ABSCIEX5800型质谱仪上获得；紫外可见吸收光谱在ShimadzuUV-2700紫外-可见吸收光谱仪上完成；荧光发射光谱由PerkinElmerLS-55荧光光谱仪上测定；血吸虫成虫荧光成像在OLYMPUSFV1000本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种近红外荧光染料，其特征在于：具有下式结构的荧光染料。
【技术特征摘要】
1.一种近红外荧光染料，其特征在于：具有下式结构的荧光染料。2.根据权利要求1所述的一种近红外荧光染料，其特征在于：具有共轭二烯键结构，更具体的是分子结构通过三个烯键链接。3.根据权利要求1所述的一种近红外荧光染料，其特征在于：亲水基团具有磺酸基(-SO3H)和羧基(-COOH)。4.根据权利要求1所述的一种近红外荧光染料的合成方法，其特征在于：荧光染料可通过以下路线合成：化合物1,1,2-三甲基-1H-苯并吲哚...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴勇权，范小林，江天宇，曾冠杰，曾红，李勋，
申请(专利权)人：赣南师范学院，
类型：发明
国别省市：江西;36
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