一种血清英夫利西ELISA检测试剂盒和检测方法技术

本发明专利技术公开了一种血清英夫利西ELISA检测试剂盒和检测方法。包括TNF‑α包被的ELISA板、HRP标记的抗Fc段IgG抗体、四甲基联苯胺(TMB)、H2SO4和辅助试剂组成；所述的TNF‑α包被的ELISA板是通过以下方法制备的：用TNF‑α包被ELISA板，由此得到TNF‑α包被的ELISA板。本发明专利技术的检测方法和检测试剂盒敏感度高，操作简便，费用相对HPLC‑HMSA低廉。

【技术实现步骤摘要】

：本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种血清英夫利西ELISA检测试剂盒和检测方法。
技术介绍
：英夫利西单克隆抗体(infliximab,IFX)是由75％人源性IgG1κ轻链的恒定区和25％鼠源性的多变区组成的嵌合型单克隆抗体，能够特异性结合游离和膜连的肿瘤坏死因子α(TNF-α)，进而阻断TNF-α激活的NF-κB促炎通路，促发过度活化的淋巴细胞凋亡，最终抑制免疫紊乱引起的组织损伤，是目前广泛应用于治疗风湿性疾病和炎症性肠病的生物制剂药物(KojiSono,Cytokine59,2012；MatteoBosani,Biologics:Targets&Therapy2009；GertVanAssche,Gut,2012)。其中尤其对于炎症性肠病的治疗，相比传统药物如5-氨基水杨酸、糖皮质激素、免疫抑制剂(硫唑嘌呤、6-巯基嘌呤)等，IFX能够迅速诱导并长期维持黏膜愈合，而后者对于延长炎症性肠病的无激素缓解期、减少并发症、减少住院率及手术率，最终延缓疾病的自然病程发展具有重要意义(2012ECCO)。IFX能够发挥促进肠道粘膜愈合的效应主要取决于药物进入患者体内后达到并维持足够的治疗窗浓度，目前研究表明IBD患者维持病情缓解需要IFX浓度维持在3–7μg/mL(NielsVandeCasteeleGastroenterology2015)，当IBD患者IFX测定浓度低于3μg/mL，采用加大IFX剂量输注或缩短给药间隔的用药方案调整能够显著提升患者的粘膜愈合率，反之，若患者FX测定浓度高于7μg/mL，适当减量能够在不影响患者的粘膜愈合率前提下节约患者花费。因此，准确评估英夫利西的体内浓度对于患者获得更佳疗效及临床医生治疗决策具有极其重要的意义。目前测量血清IFX浓度主要是基于高效液相色谱法的同质迁移试验(highpressureliquidchromatography-basedmobilityshiftassay，HPLC-HMSA)，尽管该方法能够高效分离IFX，检测灵敏度达微克数量级，选择性好，操作自动化，但是该方法要求价格高昂的液相色谱仪并配备专业人员进行操作及维护，同时每次使用的色谱柱成本需要数万至数十万美元不等，分析时间至少数天，无法在临床上开展。
技术实现思路
：本专利技术的目的是提供一种高效、准确、经济的血清英夫利西单克隆抗体(IFX)ELISA检测试剂盒和检测方法。本专利技术的血清英夫利西(IFX)的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：首先用TNF-α包被ELISA板，将ELISA板上固定有TNF-α的孔分成待测样本孔和标准曲线孔；标准曲线孔中加入倍比稀释的已知浓度的标准品IFX，然后加入HRP标记的抗Fc段IgG抗体，而后加入底物TMB，在HRP的催化下变为蓝色，后在酸的作用下变为黄色，最后测定其吸光度值，通过已知浓度的标准品IFX的吸光度值绘制出标准曲线；在待测样本孔处加入待测血清，使血清中的IFX与TNF-α结合从而固定下来，然后加入HRP标记的抗Fc段IgG抗体，而后加入底物TMB，在HRP的催化下变为蓝色，后在酸的作用下变为黄色，最后测定其吸光度值，根据待测血清的吸光度值与上述标准曲线计算出血清中IFX的浓度。所述的测定吸光度值是在酶标仪读取450nm的吸光度值。本专利技术的第二个目的是提供血清英夫利西单克隆抗体(IFX)ELISA检测试剂盒，其特征在于，包括TNF-α包被的ELISA板、HRP标记的抗Fc段IgG抗体、四甲基联苯胺(TMB)、H2SO4和辅助试剂组成；所述的TNF-α包被的ELISA板是通过以下方法制备的：用TNF-α包被ELISA板，由此得到TNF-α包被的ELISA板。所述的辅助试剂包括pH9.6的碳酸氢盐缓冲液、质量分数1％BSA的PBS溶液、质量分数0.1％BSA的PBS溶液、体积分数0.05％PBST溶液和蒸馏水。所述的pH9.6的碳酸氢盐缓冲液每升是这样配制的：将Na2CO31.59g和NaHCO32.93g加入1L的蒸馏水中，调pH达到9.6，得到碳酸氢盐缓冲液；所述的用TNF-α包被ELISA板是用含750ng/mlTNF-α的碳酸氢盐缓冲液包被ELISA板。所述的质量分数1％BSA的PBS溶液是在pH7.4的PBS溶液(磷酸盐缓冲液)中加入BSA使其质量分数为1％，由此得到质量分数1％BSA的PBS溶液；所述的质量分数0.1％BSA的PBS溶液是在pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中加入BSA，使其浓度为质量分数0.1％，由此得到质量分数0.1％BSA的PBS溶液。所述的体积分数0.05％PBST溶液是指含体积分数0.05％Tween-20的PBS溶液，其是在pH7.4PBS溶液(磷酸盐缓冲液)中加入Tween-20，使其体积分数为0.05％，由此得到体积分数0.05％PBST溶液。本专利技术首先用TNF-α抗原包被吸附性强的ELISA塑料板，在待测样本孔处加入稀释好的待测血清，使血清中的IFX与TNF-α结合从而固定下来，而标准曲线孔处则加入已知浓度的经倍比稀释的标准品IFX，最后加入HRP标记的抗Fc段IgG抗体(Ben-HorinS,Gut,2010)，而后加入底物TMB，在辣根过氧化物酶(HRP)的催化下变为蓝色，后在酸的作用下变为黄色。最后在酶标仪读取450nm的吸光度值，通过已知浓度的标准品IFX的吸光度值绘制出标准曲线，根据待测血清的吸光度值计算出血清中IFX的浓度。本专利技术的检测方法和检测试剂盒敏感度高，操作简便，费用相对HPLC-HMSA低廉。附图说明：图1是IFX标准曲线示意图。具体实施方式：以下实施例是对本专利技术的进一步说明，而不是对本专利技术的限制。实施例1：血清IFX浓度测定：一、试剂准备：(1)TNF-α：100μgTNF-α中加入1ml无菌去离子水，在室温下静置2小时，加入4ml质量分数0.1％BSA-PBS溶液，分装到250μl的EP管中，-20℃低温保存，避免反复冻融，工作浓度为含750ng/mlTNF-α的碳酸氢盐缓冲液，使用时，用下面的碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释。(2)碳酸氢盐缓冲液：将Na2CO31.59g和NaHCO32.93g加入1L的蒸馏水，调pH达到9.6，4℃保存不能超过1个月，使用前需恢复至室温(3)IFX标准品：用BCA法测量标准品的IFX浓度，并分装到250μl的EP管保存于-20℃，可冻融2次。(4)IFX阳性对照：1ml全阴性血清(阿达木、英夫利西、抗阿达木抗体、抗英夫利西抗体都为阴性)+2ug英夫利西(5)HRP标记的抗Fc段IgG抗体：分装到250ulEP管，-80℃或-20℃低温保存。为了中期存储，可与保护性过氧化物酶溶液按1:100稀释，4℃可保存超过6个月。工作浓度为600ng/ml，2μl加入1ml1％BSA-PBS溶液即可；(6)TMB：4℃保存，使用前需恢复至室温(7)2MH2SO4：4℃保存，使用前需恢复至室温；所述的1％BSA-PBS是指质量分数1％BSA的PBS溶液，其是在pH7.4磷酸盐缓冲液(PBS)中加入BSA使其质量分数为1％，由此得到质量分数1％BSA的PBS溶液；所述的0.1％BSA-PBS是指质量分数0.1％BSA的PBS溶液，是本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种血清英夫利西单克隆抗体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：首先用TNF‑α包被ELISA板，将ELISA板上固定有TNF‑α的孔分成待测样本孔和标准曲线孔；标准曲线孔中加入倍比稀释的已知浓度的标准品IFX，然后加入HRP标记的抗Fc段IgG抗体，而后加入底物TMB，在HRP的催化下变为蓝色，后在酸的作用下变为黄色，最后测定其吸光度值，通过已知浓度的标准品IFX的吸光度值绘制出标准曲线；在待测样本孔处加入待测血清，使血清中的IFX与TNF‑α结合从而固定下来，然后加入HRP标记的抗Fc段IgG抗体，而后加入底物TMB，在HRP的催化下变为蓝色，后在酸的作用下变为黄色，最后测定其吸光度值，根据待测血清的吸光度值与上述标准曲线计算出血清中IFX的浓度。

【技术特征摘要】
1.一种血清英夫利西单克隆抗体的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：首先用TNF-α包被ELISA板，将ELISA板上固定有TNF-α的孔分成待测样本孔和标准曲线孔；标准曲线孔中加入倍比稀释的已知浓度的标准品IFX，然后加入HRP标记的抗Fc段IgG抗体，而后加入底物TMB，在HRP的催化下变为蓝色，后在酸的作用下变为黄色，最后测定其吸光度值，通过已知浓度的标准品IFX的吸光度值绘制出标准曲线；在待测样本孔处加入待测血清，使血清中的IFX与TNF-α结合从而固定下来，然后加入HRP标记的抗Fc段IgG抗体，而后加入底物TMB，在HRP的催化下变为蓝色，后在酸的作用下变为黄色，最后测定其吸光度值，根据待测血清的吸光度值与上述标准曲线计算出血清中IFX的浓度。2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于，所述的测定吸光度值是在酶标仪读取...

【专利技术属性】
技术研发人员：本·沙朗，冯婷，陈旻湖，
申请(专利权)人：本·沙朗，陈旻湖，
类型：发明
国别省市：以色列;IL