一种基于光敏生物高分子负载酶制备生物传感器的方法技术

本发明专利技术公开了一种基于光敏生物高分子负载酶制备生物传感器的方法，该制备方法包括光敏生物高分子的制备、载酶自组装纳米粒子的制备、酶生物传感器的制备三大步骤。本发明专利技术中通过光敏生物高分子与酶的自组装能实现对酶的高效负载并保持酶的活性，通过紫外光交联得到的自组装粒子聚合网络能增强涂层的稳定性并有效防止酶从传感器基质表面的渗漏，所构建的酶生物传感器具有高特异性、稳定性好、检测范围宽等优点；自组装技术、光固化技术与电化学传感器的结合，可广泛应用于食品安全、生物医药及环保监测等领域。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及高分子材料与电化学传感器领域，特别是涉及一种通过光敏生物高分子实现对生物催化酶的有效负载，并将其用于制备酶生物传感器的方法。
技术介绍
酶作为一种生物催化剂，具有反应速度快、反应条件温和及高选择性等特点。但在实际使用过程中，多数酶对环境较为敏感，在高温、强酸、强碱、紫外线、热、金属盐等外界条件的影响下，酶的二级、三级结构发生改变，导致酶失去活性，从而丧失了其功能性。酶生物传感器作为一种研究最为广泛的生物传感器，是将酶作为生物敏感基元，通过各种物理、化学信号转换器捕捉目标物与敏感基元之间的反应所产生的与目标物浓度成比例关系的可测信号，实现对目标物定量测定的分析仪器。酶生物传感器主要组成部分是感受器(固定化酶)和换能器。作为生物敏感基元的感受器(固定化酶)是整个生物传感器的技术核心。感受器的制备包括选择最佳的载体材料以及在载体上固定化酶。换能器可以感知酶与待测物质特异性结合产生的微小变化，并把这种变化转变成其他可以记录的信号，如：电信号、热信号以及密度、质量等性质的变化。与传统分析方法相比，酶生物传感器具有独特的优点：(1)选择性高，能够直接在复杂试样中进行测定；(2)反复多次使用；(3)响应快；(4)体积小，可实现在线监测；(5)成本低，便于推广普及。在酶生物传感器的构建过程中，酶的固定化(enzymeimmobilization)是影响传感器性能的关键步骤。酶的固定化是指采用有机或无机固体材料作为载体，将酶包埋起来或束缚、限制于载体的表面和微孔中，使其仍具有催化活性，并可回收及重复使用的酶化学方法与技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足，呈现出贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶的性能取决于固定化酶所使用载体材料的性质和固定化方法，而酶的固定化程度直接决定酶生物传感器的检测性能。传统酶固定化技术有化学法和物理法两大类。化学法包括交联法、共价结合法，是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上，使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来，而形成相对分子质量更大、不溶性的固定化酶的方法。物理方法包括结晶法、分散法、物理吸附法、离子结合法、包埋法等。通过物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应，其整体结构保持不变，酶的催化活性可得到更好的得以保留。然而，由于物理固定手段的结合作用通常为非共价键作用，从而易于在贮存和使用中造成酶的渗漏。因此，如何充分利用天然高分子载体、纳米技术、膜技术等来固定酶，必定会成为研究的热点。天然生物高分子如壳聚糖、海藻酸钠等，由于其来源广泛、具有较强的亲和性且具有优异的生物相容性，因此被广泛用于酶的负载。由于生物高分子通常是生物可降解的，其在工业上应用也可以实现可持续性。对生物高分子进行共价改性赋予其更丰富的功能性，将使得天然高分子在生物医用材料、生物电子器件领域有极为广泛的应用前景。大分子自组装是指大分子间通过非共价键作用而自发形成热力学稳定且具有明确有序结构的聚集体的过程。自组装的驱动力包括具有可逆性和选择性的氢键、静电作用、亲疏水作用、范德华力、金属配位等非共价键作用以及能够可逆形成和破坏的共价键作用力。通过静电自组装技术可实现对大分子蛋白如酶的稳定负载，制得聚合物-酶自组装聚集体，这种自组装聚集体能够有效地实现对酶的负载。然而，目前通过自组装制备光敏性生物高分子-酶自组装纳米粒子，并将其用于构造酶生物传感器尚未见报道。
技术实现思路
针对现有技术存在的上述问题，本专利技术旨在提供一种基于光敏生物高分子负载酶制备自组装复合纳米粒子并将其用于构建酶生物传感器的制备方法。本专利技术中采用的光敏生物高分子具有良好的生物相容性和蛋白亲和性，所构建的自组装纳米粒子能有效提高酶的负载量，而通过光交联能有效增强酶在传感器基质表面的固定效果，从而抑制酶的渗漏。本专利技术所采用的技术操作简便，所构建的传感器对于待分析物具有灵敏度高、特异性强、稳定性好等优点。本专利技术的技术方案如下：一种基于光敏生物高分子负载酶制备生物传感器的方法，光敏生物高分子的制备、载酶自组装纳米粒子的制备、酶生物传感器的构建的具体步骤如下：(1)光敏生物高分子的制备将生物大分子、引发剂、小分子光敏单体依次逐滴加入反应溶剂中，在0℃～100℃下反应12h～48h，使生物大分子与光敏单体反应完全；将所得反应物溶液用沉淀剂沉淀后转入透析袋透析1～14d以除去未反应的单体及引发剂；将纯化后的聚合物溶液进行冷冻干燥得到光敏生物大分子；所述生物大分子为聚谷氨酸、壳聚糖、葡聚糖、肝素、软骨素、透明质酸、海藻酸钠、淀粉、纤维素的任一种；所述引发剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC﹒HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、三苯基膦(TPP)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)中的一种或几种；所述小分子光敏单体为无毒的4-甲基伞形酮、7-羟基香豆素、4-羟基香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素、3-氯-7-羟基-4-甲基香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酰氯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸缩水甘油酯、甲基丙烯酸酐、甲基丙烯酰胺、邻苯二甲酸酐、甲基丙烯酰氧乙基异氰酸酯、N-羟甲基丙烯酰胺、聚乙二醇二丙烯酸酯、肉桂酸、肉桂酸衍生物、羟基肉桂酸、衣康酸、咖啡酸、鞣酸、脱氢枞酸、松香酸、海松酸、呋喃衍生物。(2)载酶自组装纳米粒子的制备在常温下，将酶溶液逐滴加入到1～10倍其体积的光敏性生物高分子溶液中，持续搅拌使酶与生物高分子通过静电或氢键作用自组装形成复合纳米粒子，将所得载酶自组装纳米粒子溶液通过孔隙800nm的针式过滤器，得到粒径均匀分布复合纳米粒子，4℃下保存；所述酶为辣根过氧化物酶(HRP)、乳酸氧化酶(LOx)、葡萄糖氧化酶(GOx)、胆固醇酶、脂肪酶、漆酶、酪氨酸酶、胆碱酯酶、有机磷水解酶、硝酸还原酶、亚硝酸盐还原酶、高氯酸盐还原酶、脲酶、碳酸酐酶中的一种或多种；所述酶溶液浓度为0.01～10mg/mL,所述光敏性生物高分子溶液浓度为0.01～100mg/mL,所述自组装的反应溶液pH值为2～9，所述反应时间为2h～24h。(3)酶生物传感器的构建向步骤(2)所述载酶自组装纳米粒子溶液中添加无机导电纳米粒子后搅拌至混合均匀，通过滴涂或电泳沉积的方法将混合溶液修饰在传感电极表面，随后通过紫外光交联以增强涂层的稳定性得到稳定的复合生物传感膜，室温自然干燥，制得酶生物传感器；所述无机导电纳米粒子为金纳米粒子、银纳米粒子、碳纳米管、石墨烯中的一种或几种的组合。所述无机导电纳米粒子添加量为质量分数0.01％～10％；所述电极为金电极、铂电极、玻碳电极、柔性电极、丝网印刷电极；所述电极在使用前需经预处理，预处理的方法为：将电极抛光至镜面，依次用无水乙醇、超纯水、无水乙醇分别超声3min清洗电极表面，氮气吹干电极；所述滴涂方法为移取5～100μL载酶复合纳米粒子与无机导电纳米粒子的混合溶液滴涂于电极表面，室温下自然干燥，形成复合传感涂层，制得酶生物传感器；所述电泳沉积方法为将电极浸入大分子复合胶束溶液中，施加与复合胶束荷本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于光敏生物高分子负载酶制备生物传感器的方法，其特征在于光敏生物高分子的制备、载酶自组装纳米粒子的制备、酶生物传感器的构建的具体步骤如下：(1)光敏生物高分子的制备将生物大分子、引发剂、小分子光敏单体依次逐滴加入反应溶剂中，在0℃～100℃下反应12h～48h，使生物大分子与光敏单体反应完全；将所得反应物溶液用沉淀剂沉淀后转入透析袋透析1～14d以除去未反应的单体及引发剂；将纯化后的聚合物溶液进行冷冻干燥得到光敏生物大分子；(2)载酶自组装纳米粒子的制备在常温下，将酶溶液逐滴加入到1～10倍其体积的光敏性生物高分子溶液中，持续搅拌使酶与生物高分子通过静电或氢键作用自组装形成复合纳米粒子，将所得载酶自组装纳米粒子溶液通过孔隙800nm的针式过滤器，得到粒径均匀分布复合纳米粒子，4℃下保存；(3)酶生物传感器的构建向步骤(2)所述载酶自组装纳米粒子溶液中添加0.01％～10％的无机导电纳米粒子后搅拌至混合均匀，通过滴涂或电泳沉积的方法将混合溶液修饰在传感电极表面，随后通过紫外光交联以增强涂层的稳定性得到稳定的复合生物传感膜，室温自然干燥，制得酶生物传感器。采用的电极为金电极、铂电极、玻碳电极、柔性电极、丝网印刷电极的任一种；所述电极在使用前需经预处理，预处理的方法为：将电极抛光至镜面，依次用无水乙醇、超纯水、无水乙醇分别超声3min清洗电极表面，氮气吹干电极。...

【技术特征摘要】
1.一种基于光敏生物高分子负载酶制备生物传感器的方法，其特征在于光敏生物高分子的制备、载酶自组装纳米粒子的制备、酶生物传感器的构建的具体步骤如下：(1)光敏生物高分子的制备将生物大分子、引发剂、小分子光敏单体依次逐滴加入反应溶剂中，在0℃～100℃下反应12h～48h，使生物大分子与光敏单体反应完全；将所得反应物溶液用沉淀剂沉淀后转入透析袋透析1～14d以除去未反应的单体及引发剂；将纯化后的聚合物溶液进行冷冻干燥得到光敏生物大分子；(2)载酶自组装纳米粒子的制备在常温下，将酶溶液逐滴加入到1～10倍其体积的光敏性生物高分子溶液中，持续搅拌使酶与生物高分子通过静电或氢键作用自组装形成复合纳米粒子，将所得载酶自组装纳米粒子溶液通过孔隙800nm的针式过滤器，得到粒径均匀分布复合纳米粒子，4℃下保存；(3)酶生物传感器的构建向步骤(2)所述载酶自组装纳米粒子溶液中添加0.01％～10％的无机导电纳米粒子后搅拌至混合均匀，通过滴涂或电泳沉积的方法将混合溶液修饰在传感电极表面，随后通过紫外光交联以增强涂层的稳定性得到稳定的复合生物传感膜，室温自然干燥，制得酶生物传感器。采用的电极为金电极、铂电极、玻碳电极、柔性电极、丝网印刷电极的任一种；所述电极在使用前需经预处理，预处理的方法为：将电极抛光至镜面，依次用无水乙醇、超纯水、无水乙醇分别超声3min清洗电极表面，氮气吹干电极。2.根据权利要求1所述的基于光敏生物高分子负载酶制备生物传感器的方法，其特征在于所述步骤(1)中所述生物大分子为聚谷氨酸、壳聚糖、葡聚糖、肝素、软骨素、透明质酸、海藻酸钠、淀粉、纤维素的任一种。3.根据权利要求1所述的基于光敏生物高分子负载酶制备生物传感器的方法，其特征在于所述步骤(1)中所述引发剂为1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC﹒HCl)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、二环己基碳二亚胺(DCC)、1-羟基苯并三唑(HOBT)、三苯基膦(TPP)、4-二甲氨基吡啶(DMAP)中的一种或几种。4.根据权利要求1所述的基于光敏生物高分子负载酶制备生物传感器的方法，其特征在于所述步骤(1)中所述小分子光敏单体为无毒的4-甲基伞形酮、7-羟基香豆素、4-羟基香豆素、7-氨基-4-甲基香豆...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘晓亚，许升，吴倩，王艺晨，赵伟，罗静，朱叶，魏玮，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32