一种波赛链霉菌及其生产表柔红霉素的方法技术

本发明专利技术属于生物医药领域，涉及一种保藏号为CGMCC NO.10159的波赛链霉菌及其在生产表柔红霉素中的应用。本发明专利技术还提供了利用该菌生产表柔红霉素的方法，包括将本发明专利技术的波赛链霉菌在含有可同化的碳源、氮源的培养基里进行有氧发酵。本发明专利技术的波赛链霉菌发酵产量高、菌种稳定，利用该菌生产表柔红霉素简化了生产工艺，有利于降低生产成本和减少环境污染。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物医药领域，涉及一种波赛链霉菌及其应用。
技术介绍
蒽环类抗生素是应用最广泛的抗肿瘤抗生素。其中表柔红霉素是重要的抗肿瘤药物，同时也是工业生产表阿霉素的重要前体。表阿霉素与阿霉素相比较，抗肿瘤活性相当，但是心脏毒性和骨髓毒性比阿霉素低，并且随着新剂型的发展、同其它抗肿瘤药物新组合的应用使得表阿霉素在临床上的应用越来越广泛。工业生产表阿霉素一般以柔红霉素为原料，采用化学半合成的方法生产。专利US5874550披露了一种表阿霉素的合成方法，首先通过发酵得到柔红霉素，然后将柔红霉素4号位的羟基氧化成酮基，再将这个酮基立体特异性地还原得到表柔红霉素，通过表柔红霉素最终合成得到表阿霉素。从柔红霉素到表柔红霉素再到表阿霉素，需要经过多步条件要求苛刻的反应过程，工艺复杂，技术难度大，环保成本高。如果采用微生物发酵方法直接生产表柔红霉素可简化表阿霉素的合成步骤，大大节约成本，提高效率。表柔红霉素结构如下：目前已有报道表柔红霉素的产生菌种。国际专利申请WO2006111561中公开了通过对链霉菌属中波赛链霉菌的菌株进行诱变处理，获得一株表柔红霉素生产菌株，其发酵液中表柔红霉素产量在100mg/L以上。德国的W.C.贺利氏有限公司在美国专利申请US20100143977中公开了一种由波赛链霉菌经遗传修饰的基因工程菌株，其发酵液中表柔红霉素产量在500mg/L以上。但这些菌株大多为通过基因工程手段构建的新菌种，对实验条件和技术人员的水平要求高，菌种不够稳定，而且菌种发酵产量普遍较低，基本上还停留在实验室阶段，不利于形成产业化。因此，寻找能够产生表柔红霉素的新微生物菌种和新的制备方法的工作仍在继续进行中。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种生产表柔红霉素的新菌株，以解决上述问题。本专利技术的一个方面在于提供一种能生产表柔红霉素的微生物菌株。该菌株为波赛链霉菌(Streptomycespeucetius)HS1402001，于2014年12月11日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所)，保藏号为CGMCCNO.10159，并登记入册，证明存活。本专利技术的另一方面是提供波赛链霉菌HS1402001在生产表柔红霉素或含有表柔红霉素的药物组合物中的应用。本专利技术的另一方面是提供一种利用波赛链霉菌HS1402001生产表柔红霉素的方法，该方法包括将波赛链霉菌HS1402001在含有可同化的碳源、氮源的营养培养基里进行有氧发酵。优选地，上述可同化的碳源为淀粉、糊精、葡萄糖、工业糖蜜、甘油、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇中的一种或几种；其中，所述糊精为麦芽糊精和玉米糊精中的一种或几种，所述淀粉为玉米淀粉、土豆淀粉和红薯淀粉中的一种或几种，所述淀粉可以制成可溶性淀粉。优选地，上述可同化的氮源为酵母抽提物、酵母粉、牛肉浸膏、蛋白胨(如胰蛋白胨)、黄豆饼粉、棉籽饼粉、花生饼粉、麸质粉、玉米浆干粉、麸皮、尿素、铵盐、硝酸盐中的一种或几种；其中，所述酵母抽提物包括酵母抽提粉和/或酵母膏。优选地，所述发酵培养的温度为20℃-40℃，优选为25℃-30℃；pH为6.5-7.5，优选为6.8左右；培养时间为120-240小时；通气量为0.5-1.0vvm。所述发酵方式为液体深层发酵。本专利技术中，表柔红霉素可通过以下HPLC方法进行检测：色谱柱为C18柱，5μm，4.6×250mm；流动相为，缓冲液∶乙腈∶甲醇＝500∶500∶60；缓冲液：取十二烷基硫酸钠1.44g和磷酸0.68ml溶于500ml超纯水中制备得到；流速：1.35ml/min；检测波长：254nm；进样量：10μl。本专利技术与现有技术相比具有以下优点：1、简化生产工艺。本专利技术所述菌种能够通过直接发酵方法生产表柔红霉素或其类似物，简化了从柔红霉素经化学合成得到表阿霉素的工艺，有利于降低生产成本和减少环境污染。2、提高发酵单位。跟现有技术中的表柔红霉素生产菌相比，利用本专利技术的波赛链霉菌生产表柔红霉素的产量有了大幅度提高，达到了工业化生产的要求。3、发酵产量高且菌种稳定。现有表柔红霉素生产菌种多为基因工程菌，本专利技术所述菌为通过等离子体诱变而来，发酵产量高，较基因工程菌更为稳定，且操作简便、安全无毒。附图说明图1显示了本专利技术的波赛链霉菌HS1402001在ISP2培养基上的菌落形态；图2为柔红霉素与表柔红霉素标准品混合物的HPLC图谱；图3为本专利技术的波赛链霉菌HS1402001在实施例1中产生的发酵液的HPLC图谱；图4为本专利技术的波赛链霉菌HS1402001在实施例1中产生的表柔红霉素的MS图谱；图5为本专利技术的波赛链霉菌HS1402001在实施例1中产生的表柔红霉素的1H-NMR图谱；图6为本专利技术的波赛链霉菌HS1402001在实施例1中产生的表柔红霉素的13C-NMR图谱。具体实施方式在本专利技术中，波赛链霉菌HS1402001、菌株HS1402001以及HS1402001均表示本专利技术提供的表柔红霉素生产菌，即，保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为CGMCCNO.10159的菌株。如未有特殊说明，以下实施例中涉及的培养基、制备方法、培养方法、检测方法等均为本领域公知的，使用的各种试剂均可以从普通生化试剂商店或供应商处购得。本申请中，“通气量”表示通入经过滤除菌的无菌空气的量。实施例1：菌株制备和筛选本专利技术的菌株HS1402001为将购自美国菌种保藏中心(ATCC)的柔红霉素生产菌StreptomycespeucetiusATCC29050通过等离子体诱变而得到的表柔红霉素生产菌株。将柔红霉素的生产菌StreptomycespeucetiusATCC29050涂布于ISP2平皿培养基上，置于30℃培养8-10天，用接种铲挑取菌落，制得孢子悬液，供等离子体诱变处理。取待处理的菌悬液10μL均匀涂布在载片表面，用无菌镊子将载片放到等离子诱变托盘的对应孔位。调节旋转定位台旋钮，使载片与等离子体发生器(无锡源清天木生物科技有限公司；型号：ARTP-II)射流出口间距约为2mm，并固定升降台。保持气体流量为10SLM，入射功率为120W，设置处理时间为50s。处理完毕后，将载片放入盛有1mL生理盐水的EP管中震荡洗脱1min。将洗脱后的菌悬液经适当稀释后涂布于ISP2平板，并以未经诱变处理的菌悬液同样经适当稀释后涂布于ISP2平板作为对照。置于30℃培养8-10天后，检查菌落数，并计算致死率。随机挑选经过等离子体诱变后的单菌落25000株，进行摇瓶发酵，HPLC检测是否产表柔红霉素以及产生的表柔红霉素的量。从而筛选出突变菌株HS1402001，此突变菌株发酵产物的HPLC分析结果见图3，以图2的柔红霉素和表柔红霉素标准品混合物的HPLC图谱作为对照，可见，此突变菌株只产表柔红霉素，不产柔红霉素。进一步做该表柔红霉素的MS、1H-NMR和13C-NMR图谱，结果分别见图4-图6。实施例2：菌株HS1402001的生物学和培养学特征该菌株的主要生物学特征为：此菌株菌落形态相对出发菌株(即柔红霉素生产菌StreptomycespeucetiusATCC29050)发生了本文档来自技高网...

【技术保护点】
波赛链霉菌HS1402001，其保藏号为CGMCC NO.10159。

【技术特征摘要】
1.波赛链霉菌HS1402001，其保藏号为CGMCCNO.10159。2.根据权利要求1所述的波赛链霉菌HS1402001在生产表柔红霉素或含有表柔红霉素的药物组合物中的应用。3.一种生产表柔红霉素的方法，该方法利用如权利要求1所述的波赛链霉菌HS1402001，将波赛链霉菌HS1402001在含有可同化的碳源、氮源的培养基里进行有氧发酵。4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述可同化的碳源为淀粉、糊精、葡萄糖、工业糖蜜、甘油、蔗糖、乳糖、麦芽糖、海藻糖、木聚糖、甘露醇、山梨醇中的一种或几种。5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述糊精为麦芽糊精和玉米糊精中的一种或几种；所述淀粉为玉米淀粉、土豆淀粉和红薯淀粉中的一种或...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩双，周敏，何莹莹，郑玲辉，白骅，
申请(专利权)人：浙江海正药业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33