一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法技术

本发明专利技术提供了一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，该技术方案首先将适体捕获探针固定在磁性微球表面，然后利用捕获探针与OTA分别结合OTA适体的竞争关系，基于适体的特异性结合能力强于互补链的结合力，得到磁性微球表面检测探针的量与待测OTA浓度的量化关系；最后，对适体传感器进行化学发光检测。其化学发光检测机制基于OTA适体链上的鸟嘌呤碱基(G)与化学发光试剂苯甲酰甲醛(PG)间的瞬时衍生化反应产生化学发光的原理实现的，从而省去了其他化学放光标记物的标记环节，在保证灵敏度的基础上简化了操作步骤，缩短了检测时间，再加之所用化学发光分析法线性范围宽、设备简单、易操作，因此有望实现全自动化检测。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分析化学
，进一步涉及核酸适配体技术，具体涉及一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法。
技术介绍
赭曲霉毒素A(ochratoxinA,OTA)是一种具有很强毒性的真菌毒素，其毒性在真菌毒素家族中位列第二位，仅次于黄曲霉毒素。OTA在自然界分布广泛，不仅污染谷物粮食，还严重污染动物性食品，对人类构成极大的威胁。鉴于食品安全问题关乎整个社会的安危，是受到国家及人民高度关注的大问题，建立OTA的高灵敏简便快速分析方法越发受到科研人员的重视。目前，很多基层食品检测部门较多采用薄层层析法进行OTA的定量检测，这也是较早的一种OTA的检测方法，但其存在灵敏度较差、检测周期长、所需试剂较多、重现性差等缺点，已然不能满足现阶段对OTA的检测要求。另外，常见的OTA检测方法还有高效液相色谱-荧光检测法、毛细管电泳-二极管阵列检测法、液相-质谱联用法、固相萃取荧光检测法等，但这些方法通常对样品中毒素纯度做了较高要求，且所使用的相关设备价格昂贵，故存在检测周期长、成本高等一些缺点，导致无法满足大批量样本快速筛查的需要。另外，OTA作为一种小分子物质，其分子量为403.82，是典型的半抗原，故有基于OTA免疫抗体分子作为识别元件的免疫检测方法，例如免疫传感、酶联免疫法等。这些方法虽然灵敏度高、特异性好，但也存在一定的局限性，比如抗体分子制备周期长、成本较高、稳定性差、易失活及易受pH、温度等环境因素影响而变性，故在不同程度上限制了免疫方法检测OTA的开展。近年来，核酸适配体技术在分析化学尤其是微量物质的定量检测中展现出了突出的技术优势。核酸适配体是通过SELEX技术体外筛选出来的能够特异性结合目标配体的寡聚核苷酸片段。以其特有的高亲和力和特异性，可作为识别探针和生物传感器，与蛋白质类抗体相比，核酸适体不仅能高效、特异性地识别和结合各种生物目标分子，还具有易标记、易合成、性质稳定等优势。然而，要获得可行的检测方法，建立高效的适配体传感器是关键所在，首先适体传感器在分子水平上应当满足实验所选择的发光体系的要求，采用何种标记物，标记物在传感器上的连接方法等都需要进行针对性设计；此外，选择何种分离载体和捕获探针可以完整收集信号物质并实现与信号物质含量成规律的发光反应，也需要根据发光体系、标记物、适配体等物质的性质进行设计；除此之外，发光体系的选择关乎最终检测结果与被检测物质真实含量之间的关系，因此也是影响检测效果的重要因素。
技术实现思路
本专利技术旨在针对现有技术的技术缺陷，提供一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，以解决现有技术中OTA检测方法灵敏性差、结果不稳定的技术缺陷。本专利技术要解决的另一技术问题是现有技术中基于适体技术的OTA化学发光检测方法，普遍需要附加标记物以提升发光灵敏性，从而导致检测步骤繁琐的技术。本专利技术要解决的再一技术问题是现有技术中基于适体技术的OTA化学发光检测方法耗时较长。为实现以上技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，包括以下步骤：1)通过氨羧反应将氨基修饰的捕获探针固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-捕获探针复合物；2)取待测样品与过量的OTA适体混合，充分反应；3)向步骤2)所得产物中加入过量的磁性微球-捕获探针复合物捕获游离的OTA适体，反应后取固相，即得到OTA适体传感器；4)将步骤3)所述OTA适体传感器与PG溶液混匀，而后检测发光信号CL值。作为优选，步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的捕获探针用量比为3:(1～2)(μg:pmol)的比例加入氨基修饰的捕获探针，于35～39℃震荡反应50～70min。作为优选，步骤1)还包括以下操作：于35～39℃震荡反应50～70min后，取固相利用PBST缓冲溶液洗涤。在该优选技术方案中，利用PBST缓冲溶液洗涤，旨在洗去多余的未固定到磁性微球表面的捕获探针，洗涤次数可以优选为3次。作为优选，步骤1)还包括以下操作：利用PBST缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的PVP溶液，于35～39℃条件下震荡50～70min。在此优选技术方案中，将固相(磁性微球)与PVP溶液混合，旨在以PVP溶液为封闭液，封闭磁性微球表面多余的结合位点，从而减少后续反应中的非特异性吸附。作为优选，步骤1)还包括以下操作：于35～39℃条件下震荡50～70min后取固相利用PBST缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于BA缓冲溶液中，即得到磁性微球-捕获探针复合物；其中所述BA缓冲溶液是含有：20mMTris，0.5MNaCl的水溶液，其pH是7.8～8.2。作为优选，步骤2)包括以下操作：取OTA适体，于85～95℃水浴5～10min，而后于2～6℃水浴8～12min，而后将过量的OTA适体与待测样品在BB适配体反应液中混合，于35～39℃条件下震荡反应55～65min。在此优选技术方案中，对OTA适体先热水浴再冷水浴的前处理方法有助于提升步骤3)中OTA适体与捕获探针的杂交效率。作为优选，步骤3)中反应条件为35～39℃震荡55～65min。该步骤用于使上一步反应后多余OTA适体与捕获探针互补杂交，从而固定到磁性微球表面。作为优选，步骤3)取固相后利用PBST缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于四丁基磷酸盐缓冲溶液中，即得到OTA适体传感器。作为优选，步骤4)所述PG溶液是以PG为溶质、以DMF为溶剂的溶液，其中PG的用量与步骤1)中磁性微球用量的比值为(2～3):3(mmoL:μL)。作为优选，以上技术方案中所述的取固相，均是通过磁性分离移去上清液实现的。作为优选，所述检测发光信号CL值，是利用BPCL微弱化学发光仪实现的。在以上技术方案中，所述PBST缓冲溶液可以是含有137mMNaCl，2.7mMKCl，10mMNa2HPO4·12H2O，2mMKH2PO4，0.05％Tween20的水溶液，其pH是7.2～7.6。所述BB适配体反应液可以是含有10mMTris，0.12MNaCl，0.005MKCl，0.02MCaCl2的水溶液，其pH是8.2～8.8。所述四丁基磷酸盐缓冲溶液可以是含有0.1M四丁基氢氧化铵的磷酸缓冲液。所述BA缓冲溶液可以是含有20mMTris，0.5MNaCl的水溶液，其pH是7.8～8.2。在以上技术方案中，所述氨基修饰的捕获探针是序列如下所示的核酸-氨基酸复合物：5’-CACCCACACCCIATCAAAAAAAAAA-NH2-3’；该物质可自试剂销售公司定制、购得。所述OTA适体是序列如下所示的DNA片段：5’-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACA-3’，亦可自市面购得。所述过量的OTA适体，是指OTA适体与OTA的特异性结合反应中，OTA适体的量较多、使结合反应完成后仍有未结合OTA适体游离于体系中的情形；具体的OTA适体用量可根据对待测样品中OTA含量的估算来确定，当然亦可参照本专利技术实施例中OTA适体用量来实施本专利技术。所述充分反应是指OTA适体与OTA的特异性结合完全。所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)通过氨羧反应将氨基修饰的捕获探针固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球‑捕获探针复合物；2)取待测样品与过量的OTA适体混合，充分反应；3)向步骤2)所得产物中加入过量的磁性微球‑捕获探针复合物捕获游离的OTA适体，反应后取固相，即得到OTA适体传感器；4)将步骤3)所述OTA适体传感器与PG溶液混匀，而后检测发光信号CL值。

【技术特征摘要】
1.一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于包括以下步骤：1)通过氨羧反应将氨基修饰的捕获探针固定在羧基磁性微球表面，得到磁性微球-捕获探针复合物；2)取待测样品与过量的OTA适体混合，充分反应；3)向步骤2)所得产物中加入过量的磁性微球-捕获探针复合物捕获游离的OTA适体，反应后取固相，即得到OTA适体传感器；4)将步骤3)所述OTA适体传感器与PG溶液混匀，而后检测发光信号CL值。2.根据权利要求1所述的一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于步骤1)包括以下操作：取磁性微球，利用0.05～0.2M的咪唑缓冲溶液洗涤，而后取固相重悬于含有EDC的咪唑缓冲溶液中，于35～39℃震荡孵育15～25min，而后以磁性微球与氨基修饰的捕获探针用量比为3:(1～2)(μg:pmol)的比例加入氨基修饰的捕获探针，于35～39℃震荡反应50～70min。3.根据权利要求2所述的一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于步骤1)还包括以下操作：于35～39℃震荡反应50～70min后，取固相利用PBST缓冲溶液洗涤。4.根据权利要求3所述的一种基于无标记适体传感器的OTA化学发光检测方法，其特征在于步骤1)还包括以下操作：利用PBST缓冲溶液洗涤后，取固相加入8～12％的PVP溶液，于35～39℃条件下震荡50～70min。5.根据权利要求4所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：严喜鸾，刘杰，肖义陂，
申请(专利权)人：南昌大学，
类型：发明
国别省市：江西;36