饱和共振能量转移超分辨探针及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种饱和共振能量转移超分辨的探针及其制备方法和应用。该探针包括以下的组成部分：荧光蛋白、与所述荧光蛋白连接的抗所述荧光蛋白的重链单域抗体VHH和与所述重链单域抗体VHH连接的有机荧光分子，所述有机荧光分子与所述荧光蛋白互为饱和共振能量转移供体和饱和共振能量转移受体。所述的探针可以方便地对细胞内的荧光蛋白进行超分辨成像，而且还可以进行多色、活细胞的饱和共振能量转移超分辨成像。大大简化了标记步骤，解决了多色成像和活细胞成像的问题。

【技术实现步骤摘要】

本领域涉及超分辨成像领域，具体涉及一种饱和共振能量转移超分辨的探针及其制备方法和应用。
技术介绍
光学显微成像技术由于能够对细胞开展无损伤、实时动态的直接观察，进而揭示纷繁复杂的生命现象的内在机制而备受关注，是广泛应用于生物学领域的重要技术手段。其发展贯穿着细胞生物学发展的始终，是生命科学领域的主要推动力之一。可以认为，光学细胞成像显微系统的分辨率在很大程度上限制和决定了生物学在多小的微观尺度上开展研究。细胞及亚细胞结构大多处于纳米尺度，如重要的细胞器核糖体直径仅有25纳米，蛋白质分子及复合物则更是在10纳米以下。近年来系统生物学(SystemsBiology)的发展更是迫切要求细胞成像技术的分辨率从亚微米尺度(>100纳米)进入纳米尺度(<100纳米)，以从更为深入的角度了解细胞内各功能单元及其网络的局域和整体组织方式。然而，当我们利用光波来进行显微观测时，量子力学中的“测不准”原理为光学显微镜的分辨率设置了一道不可逾越的屏障，即所谓的光学衍射极限。自从1872年德国科学家阿贝提出光学衍射极限(即分辨率最高只能为光波长的一半左右)的概念以来，光学显微系统的分辨率一直未能得到显著的提高。目前，传统的光学显微镜的横向空间分辨率最高仅为200纳米，纵向分辨率约为500纳米，这很明显不能达到对细胞内细微结构观察的要求，距离理想的纳米分辨率相差甚远。近年来人们通过对非线性光学的探索取得了突破了光学衍射极限范围的成像。人们利用那些非微扰的、高度的非线性光学效应来达到超分辨成像，例如受激发射损耗显微镜(stimulatedemissiondepletionmicroscopy，STED)的超分辨能力来自于荧光饱和淬灭过程中的高度非线性；饱和结构光照明显微镜(SaturatedPatternedExcitationMicroscopy，SPEM)利用了荧光饱和激发过程中的高度非线性；而随机光学重建显微术(Stochasticopticalreconstructionmicroscopy，STORM)利用出射荧光光子数与定位精度的非线性关系等。这些超分辨荧光显微镜(Super-ResolutionFluorescenceMicroscopy)，都可以达到约数十纳米的分辨率，为研究细胞内部的精细结构提供了前所未有的手段。饱和共振能量转移超分辨技术(SaturatedFluorescenceresonanceenergytransfer(FRET)Microscopy,SFM)使用一对高效荧光共振能量转移(FRET)的分子对作为标记，利用该探针的供体荧光对激发光强产生的高度非线性效应，可以在普通的激光共聚焦显微镜(confocal)上实现超分辨成像。所使用的FRET对的能量传递效率越高，供体荧光与激发光强之间的非线性度就越大，获得的超分辨效果也就越好。而能量传递的效率与供体和受体之间距离的6次方成倒数，即距离越小能量传递效率越高。因而设计一个高效率、易标记的FRET对探针是SFM实现的重要内容。为实现SFM的细胞内成像，需要在目标蛋白上标记上一对超高效FRET对。由于标记技术的限制，实现这一目的并不容易。因此亟需一种同时满足在纳米尺度上产生超高的FRET效率，并且能够在细胞内表达的FRET对探针，用以实现SFM超高分辨率的活细胞多色成像。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于，克服现有技术中传统的光学显微镜的横向空间分辨率达不到对细胞内细微结构观察的要求的困难，提供一种应用于饱和共振能量转移超分辨(SFM)的探针，产生极高的FRET效率，能被应用于普通的激光共聚焦显微镜中，突破光学衍射极限，达到SFM纳米尺度的分辨率，同时所述探针不会产生免疫反应，能够实现SFM超高分辨率的活细胞多色成像。高效荧光共振能量转移(FRET)是指当两个荧光团相距在1～10nm之间时，激发态的供体可以将能量通过偶极-偶极相互作用的形式传递给基态的受体。荧光供体与荧光受体之间的FRET效率越高，供体荧光与激发光强之间的非线性度就越大，获得的超分辨效果也就越好。而FRET效率与荧光供体与荧光受体之间距离的6次方成倒数，所以要尽可能地减少两者之间的举例以提高FRET效率，获得超过光学衍射极限的分辨率。本专利技术提供一种饱和共振能量转移超分辨的探针，其包括以下的组成部分：荧光蛋白、与所述荧光蛋白连接的抗所述荧光蛋白的重链单域抗体VHH和与所述重链单域抗体VHH连接的有机荧光分子，所述有机荧光分子与所述荧光蛋白互为饱和共振能量转移供体和饱和共振能量转移受体。所述的重链单域抗体VHH(nanobody)是指从骆驼或鲨鱼的重链抗体中提取出的单链抗体片段，其包含了抗体中的一个可变域(VH)，只有完整抗体1/10左右的质量。其直径为2nm，体积为2nm*2nm*3nm，能够与所述的荧光蛋白进行特异性结合。同时，所述的重链单域抗体VHH有良好的热稳定性和化学稳定性，不会在体内产生免疫反应；所述的重链单域抗体VHH分子质量低，能更容易渗透到组织中去。较佳地，所述的重链单域抗体VHH为骆驼重链单域抗体VHH。所述的荧光蛋白为本领域常规的荧光蛋白，较佳地为ECFP、EBFP、GFP、EGFP、YFP、mCitrine、RFP、mCherry、mPlum和mKate2中的一种或多种，更佳地为GFP、CFP、YFP和mKate2中的一种或多种。所述的有机荧光分子为本领域常规的有机荧光分子，即吸收某一波长的光波后能发射出另一波长大于吸收光的光波的有机分子，一般含有苯环或杂环并带有共轭双键。较佳地为FITC、Cy3、Cy5、Atto425、Atto465、Atto488、Atto514、Atto550、Atto594、Atto633、Atto647、Atto740、Alexa405、Alexa488、Alexa546、Alexa555、Alexa633和Alexa750中的一种或多种，更佳地为Alexa546、Atto550、Alexa555、Alexa488、Atto425和Alexa633中的一种或多种。所述荧光蛋白和抗所述荧光蛋白的重链单域抗体VHH的连接为本领域常规的连接，较佳地为通过共价键连接。所述重链单域抗体VHH和所述有机荧光分子的连接为本领域常规的连接，较佳地为通过共价键连接。所述荧光蛋白和所述有机荧光分子成为一对高效荧光共振能量转移(FRET)的荧光分子对，分别作为FRET对的供体和受体，或者，受体和供体。其中，FRET对的供体的发射谱与受体的吸收谱有部分重叠。两者在很短的距离内产生大于95％以上的FRET效率的能力转移，实现SFM成像。本专利技术提供一种多色饱和共振能量转移超分辨的方法，其包括以下的步骤，同时使用一种以上所述的饱和共振能量转移超分辨的探针，所述的探针中的重链单域抗体VHH分别抗一种以上的荧光蛋白。本专利技术提供一种活细胞饱和共振能量转移超分辨探针，其包括以下的组成部分：重链单域抗体VHH和与所述重链单域抗体VHH连接的有机荧光分子。较佳地，所述的重链单域抗体VHH为骆驼重链单域抗体VHH。由于重链单域抗体VHH可以在活细胞内发挥着作用，所述的活细胞饱和共振能量转移超分辨探针亦本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种饱和共振能量转移超分辨的探针，其特征在于，其包括以下的组成部分：荧光蛋白、与所述荧光蛋白连接的抗所述荧光蛋白的重链单域抗体VHH和与所述重链单域抗体VHH连接的有机荧光分子，所述有机荧光分子与所述荧光蛋白互为饱和共振能量转移供体和饱和共振能量转移受体。

【技术特征摘要】
1.一种饱和共振能量转移超分辨的探针，其特征在于，其包括以下的组成部分：荧光蛋白、与所述荧光蛋白连接的抗所述荧光蛋白的重链单域抗体VHH和与所述重链单域抗体VHH连接的有机荧光分子，所述有机荧光分子与所述荧光蛋白互为饱和共振能量转移供体和饱和共振能量转移受体。2.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述的荧光蛋白为ECFP、EBFP、GFP、EGFP、YFP、mCitrine、RFP、mCherry、mPlum和mKate2中的一种或多种，较佳地为GFP、CFP、YFP和mKate2中的一种或多种；和/或，所述重链单域抗体VHH为骆驼重链单域抗体VHH。3.如权利要求1所述的探针，其特征在于，所述的有机荧光分子为FITC、Cy3、Cy5、Atto425、Atto465、Atto488、Atto514、Atto550、Atto594、Atto633、Atto647、Atto740、Alexa405、Alexa488、Alexa546、Alexa555、Alexa633和Alexa750中的一种或多种，更佳地为Alexa546、Atto550、Alexa555、Alexa488、Atto425和Alexa633中的一种或多种。4.一种多色饱和共振能量转移超分辨的方法，其特征在于，其包括以下的步骤，同时使用一种以上如权利要求1～3中任一项所述的探针，所述的探针中的重链单域抗体VHH分别抗一种以上的荧光蛋白。5.一种活细胞...

【专利技术属性】
技术研发人员：侯尚国，邓素辉，程亚，黄庆，樊春海，
申请(专利权)人：中国科学院上海应用物理研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31