一种重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌、其构建方法及其应用技术

本发明专利技术涉及疫苗技术领域，具体涉及一种重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌、其构建方法及其应用。其制备步骤主要包括：采用RT‑PCR的方法扩增EV71的主要抗原片段VP1的基因序列，将扩增后的基因片段通过酶切修饰后连接到乳酸菌表达载体pNZ8048，电转化到乳酸菌MG1363细胞内从而获得重组菌，之后使用1.5ng/mL的乳酸菌诱导剂诱导，通过SDS‑PAGE和Western blot分析EV71 VP1表达情况。将表达的重组EV71 VP1乳酸菌作为口服疫苗饲喂小鼠后可以使小鼠产生针对EV71的中和抗体，该发明专利技术将为手足口病口服疫苗的研究提供一定的基础。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及疫苗
，具体涉及一种重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌、其构建方法及其应用。
技术介绍
手足口病（hand,footandmouthdisease，HFMD）是由人类肠道病毒引起以发热和手、足、口腔部位的皮疹或疱疹性咽峡炎为主要临床特征的一种急性传染病。HFMD在5岁以下儿童中高发，主要由肠道病毒71型（humanenterovirus71，EV71）和柯萨奇病毒A16型（CoxackievirusA16，CA16）两种病原体引起的。重症可导致神经性病变如无菌性脑膜炎、病毒性脑炎、急性迟缓性麻痹、心肌炎、新生儿败血症等，甚至造成短期内猝死，对3岁以下儿童危害尤重。手足口病已成为我国亟需解决的重大公共卫生问题。然而，目前尚无针对EV71和CVA16的特效抗病毒药物，疫苗的使用被认为是控制病毒传播的最佳方法，传统的疫苗主要以静脉注射为主，存在一定危险性，研究新的疫苗非常必要。研究发现肠道病毒的中和抗原决定簇主要位于暴露于病毒外的VP1上，是诱导机体产生中和抗体的主要结构蛋白。而肠道免疫与肠道菌群有着密切关系。肠道菌群对营养物质的消化、吸收、对抗病菌及免疫调节发挥着重要作用。众多研究证实，存在于肠道黏膜表面的益生菌对肠道黏膜具有双重的保护作用，一方面它可以在肠道内定值，维护肠道微生物菌群平衡；另一方面益生菌可直接作用于宿主的免疫系统，诱发肠道免疫，并刺激胸腺、脾脏和法氏囊等免疫器官发育。乳酸杆菌是益生菌中的一种，其广泛存在于人和动物的胃肠道中，具有多种生理功能。目前正在开展的手足口病相关的疫苗一般为灭活疫苗、病毒样颗粒疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗以及表位肽疫苗等。从诱导免疫效果及保护率来看，目前最好的当属灭活疫苗，已有5个EV71的甲醛灭活疫苗进入临床试验。在EV71相关的手足口病的防控方面具有一定效果。病毒样颗粒疫苗较灭活疫苗稍差。效果较好的亚单位疫苗均采用杆状病毒表达VP1蛋白。但由于中和抗原的数量及空间结构的短缺，导致其诱导机体产生保护性抗体的能力较差。中国申请专利201210557205.0，公开了一种重组猪流行性腹泻病毒乳酸乳球菌、其构建方法及应用，利用RT-PCR扩增获得猪流行性腹泻病毒COE基因序列，设计表达引物，扩增PEDVCOE编码序列，将其连接到乳酸乳球菌表达载体中，在电转化到乳酸乳球菌NZ3900细胞内得到重组菌，获得猪流行性腹泻病毒疫苗。该专利提出了一种利用乳酸球菌作为载体的猪流行性腹泻病毒载体的方案，但针对人类的手足口病的口服免疫疫苗，并未见研究报道。
技术实现思路
为了克服现有技术中存在的缺点和不足，本专利技术的目的在于提供一种重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌的构建方法，通过该方法得到一种重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌，其可以作为口服疫苗应用。本专利技术的目的在于提供一种重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌。本专利技术的目的在于提供一种重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌表达肠道病毒71型特异性抗体的方法。本专利技术的目的在于提供一种重组人肠道病毒EV71特异性抗体的应用。根据目前国内外关于人肠道病毒71型的疫苗研究最新进展，本专利技术提出一种口服疫苗方式，即使用乳酸球菌表达载体pNZ8048，构建pNZ8048-EV71VP1重组质粒，并将重组质粒电转到乳酸球菌MG1361中，构建重组菌。之后使用重组菌饲喂小鼠，检测其抗体产生情况及其中和病毒情况，衡量疫苗的免疫效果。本专利技术的目的通过下述技术方案实现：一种重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌的构建方法，包括以下步骤：步骤一：设计引物，通过RT-PCR对肠道病毒71型VP1片段进行扩增；步骤二：将扩增后的VP1片段通过限制性内切酶KpnI，XbaI双酶切后回收，与经过同样酶修饰后回收的乳酸球菌表达载体连接构建出重组质粒，并将构建好的重组质粒测序比对；步骤三：将获得正确序列的重组质粒电转化到乳酸球菌中，得到重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌；所述步骤一中引物序列分别为：上游序列：5’-CGGGGTACCATGGGGGACAGAGTGGCAGATGTGA-3’；下游序列：5’-CTAGTCTAGATTACTAAGTTGGTTTAATGGAATCACCA-3’。所述步骤一种EV71VP1基因的扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸5min。所述步骤二中乳酸球菌表达载体为pNZ8048，得到的重组质粒为pNZ8048-EV71VP1。所述步骤三中的乳酸球菌为乳酸球菌MG1361。一种重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌，由上述的方法构建所得。一种重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌表达肠道病毒71型特异性抗体的方法，包括以下步骤：步骤1：将重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌接种于MRS培养基中，30℃培养过夜，然后按照1:100的比例再次接种到新鲜的MRS培养基中，30℃培养至OD600达到0.5；步骤2：用1.5ng/mL的乳酸球菌诱导剂诱导2-3h，得到肠道病毒71型特异性抗体。一种重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌表达肠道病毒71型特异性抗体的方法，所述步骤2是使用1.5ng/mL的乳酸链球菌素诱导对重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌进行诱导，通过SDS-PAGE和Westernblot分析肠道病毒71型VP1的表达情况。一种重组人肠道病毒71型特异性抗体，所述肠道病毒71型特异性抗体可应用于手足口病中的口服疫苗。一种手足口病口服疫苗，所述手足口病口服疫苗包括权利要求9所述的肠道病毒71型特异性抗体。目前正在开展的手足口病相关的疫苗一般为针对EV71的单个病毒的灭活疫苗、病毒样颗粒疫苗、亚单位疫苗、减毒活疫苗以及表位肽疫苗等。从诱导免疫效果及保护率来看，目前最好的当属灭活疫苗，已有5个EV71的甲醛灭活疫苗进入临床试验。在EV71相关的手足口病的防控方面具有一定效果。病毒样颗粒疫苗较灭活疫苗稍差。效果较好的亚单位疫苗均采用杆状病毒表达VP1蛋白。但由于中和抗原的数量及空间结构的短缺，导致其诱导机体产生保护性抗体的能力较差。EV71基因组编码4个结构蛋白分别为VP1-4，而研究发现肠道病毒的中和抗原决定簇主要位于暴露于病毒外的VP1上，因此其VP1片段刺激机体可以产生中和EV71的中和抗体。随着人们肠道免疫的研究进步，为口服疫苗的研究与应用提供基础。肠道免疫与肠道菌群有着密切关系。肠道菌群对营养物质的消化、吸收、对抗病菌及免疫调节发挥着重要作用。众多研究证实，存在于肠道黏膜表面的益生菌对肠道黏膜具有双重的保护作用，一方面它可以在肠道内定值，维护肠道微生物菌群平衡；另一方面益生菌可直接作用于宿主的免疫系统，诱发肠道免疫，并刺激胸腺、脾脏和法氏囊等免疫器官发育。乳酸杆菌是益生菌中的一种，其广泛存在于人和动物的胃肠道中，具有多种生理功能。有研究人员用乳酸杆菌喂小白鼠，发现在小肠中SIgA+的浆细胞数量有所增加，在轮状病毒导致的腹泻婴儿中，喂食乳酸杆菌后可使病程减短。益生菌刺激肠道淋巴细胞而发挥免疫保护作用。乳酸菌作为肠道内有益菌，其不光起到调节肠道内菌群的作用，还可以作为抗原递呈工具，刺激黏膜，引起免疫反应，因此乳酸菌是设计口服疫苗的良好载体。本研究使用乳本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：设计引物，通过RT‑PCR对肠道病毒71型VP1片段进行扩增；步骤二：将扩增后的VP1片段通过限制性内切酶Kpn I、Xba I双酶切后回收，与经过同样酶修饰后回收的乳酸球菌表达载体连接构建出重组质粒，并将构建好的重组质粒测序比对；步骤三：将获得正确序列的重组质粒电转化到乳酸球菌中，得到重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌。

【技术特征摘要】
1.一种重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤一：设计引物，通过RT-PCR对肠道病毒71型VP1片段进行扩增；步骤二：将扩增后的VP1片段通过限制性内切酶KpnI、XbaI双酶切后回收，与经过同样酶修饰后回收的乳酸球菌表达载体连接构建出重组质粒，并将构建好的重组质粒测序比对；步骤三：将获得正确序列的重组质粒电转化到乳酸球菌中，得到重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌。2.根据权利要求1所述的一种重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌的构建方法，其特征在于：所述步骤一中引物序列分别为：上游序列：5’-CGGGGTACCATGGGGGACAGAGTGGCAGATGTGA-3’；下游序列：5’-CTAGTCTAGATTACTAAGTTGGTTTAATGGAATCACCA-3’。3.根据权利要求1所述的一种重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌的构建方法，其特征在于：所述步骤一种EV71VP1基因的扩增条件为：94℃预变性5min；94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；72℃终延伸5min。4.根据权利要求1所述的一种重组人肠道病毒71型VP1乳酸球菌的构建方法，其特征在于：所述步骤二中乳酸球菌表达载体为pNZ8048，得到的重组质粒为pNZ8048-EV71VP1...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋再学，陆小梅，钟柏茂，黎四平，何晓光，马可泽，刘倩，饶春宝，马强，彭琪，
申请(专利权)人：东莞市儿童医院，东莞市儿科研究所，
类型：发明
国别省市：广东;44