一套高效分泌表达异源蛋白的工程菌及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一套高效分泌表达异源蛋白的工程菌及其应用。本发明专利技术通过将胞内质量控制体系的相关基因YmfH、YrrN、YrrO和YwpE的敲除载体分别导入枯草芽孢杆菌感受态细胞，分别获得了对应基因的缺失菌株，并在不同工程菌株中表达了CBP21和AIO6BS蛋白。通过实验证明：胞内的质量控制体系的相关基因的失活，不同程度的影响了CBP21和AIO6BS的蛋白表达。说明对胞内质量控制体系相关因子的改造，有利于提高外源蛋白的合成、稳定折叠、分泌。同时本发明专利技术的一套胞内蛋白酶敲除的工程菌株，为研究胞内蛋白酶对外源蛋白的分泌表达的影响提供有效的工具，同时也为提高外源蛋白的产量和质量提供了一套工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于生物
，具体涉及一套高效分泌表达异源蛋白的工程菌及其应用。
技术介绍
枯草芽胞杆菌，是芽胞杆菌属的一种。单个细胞0.7～0.8×2～3微米，着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。与大肠杆菌相比，枯草芽孢杆菌能把表达的重组蛋白直接分泌到培养基中，简化了下游处理的时间与成本，是一种理想的表达宿主。虽然芽孢杆菌能高效的分泌表达同源蛋白，但是异源蛋白，特别是在未修饰的宿主中，表达的质量和产率不理想。质量控制系统中的蛋白酶是影响重组蛋白表达的瓶颈之一。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种重组菌。本专利技术提供的重组菌为如下(1)或(2)：(1)所示的重组菌为降低和/或抑制枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白活性得到的菌；(2)所示的重组菌为降低和/或抑制枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白活性得到的菌。上述重组菌中，所述降低和/或抑制枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白活性为抑制或沉默枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因的表达；所述降低和/或抑制枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白活性为抑制或沉默枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因的表达。上述重组菌中，所述抑制或沉默枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因的表达为敲除枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因或其部分片段；所述抑制或沉默枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因的表达为敲除枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因或其部分片段。上述重组菌中，所述敲除枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因或其部分片段为将枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因替换为抗性基因；所述敲除枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因或其部分片段为将枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因替换为抗性基因。上述重组菌中，所述将枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因替换为抗性基因和所述将枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因替换为抗性基因可以采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或自杀质粒介导的同源重组。上述重组菌中，所述将枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因替换为抗性基因和所述将枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因替换为抗性基因均采用同源重组的方式进行；所述将枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因替换为抗性基因为将包括所述YrrN蛋白编码基因上游同源臂、抗性基因表达盒和所述YrrN蛋白编码基因下游同源臂的同源重组片段A导入枯草芽孢杆菌中；所述将枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因替换为抗性基因为将包括所述YwpE蛋白编码基因上游同源臂、抗性基因表达盒和所述YwpE蛋白编码基因下游同源臂的同源重组片段B导入枯草芽孢杆菌中。上述重组菌中，所述抗性基因为zeocin；所述同源重组片段A的核苷酸序列为序列2；所述同源重组片段B的核苷酸序列为序列4；所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌BS168。本专利技术的另一个目的是提供一种重组菌。本专利技术提供的重组菌为使上述重组菌表达几丁质结合蛋白CBP21或淬灭酶AIO6BS。上述重组菌中，所述表达的方法为将几丁质结合蛋白CBP21的编码基因或淬灭酶AIO6BS的编码基因导入上述重组菌。本专利技术还有一个目的是提供上述重组菌的新用途。本专利技术提供了上述重组菌在生产几丁质结合蛋白CBP21和/或提高几丁质结合蛋白CBP21的分泌表达水平中的应用。本专利技术还提供了上述重组菌在生产淬灭酶AIO6BS和/或提高淬灭酶AIO6BS的分泌表达水平中的应用。本专利技术还有一个目的是提供一种生产外源蛋白的方法。本专利技术提供的生产外源蛋白的方法为利用上述重组菌，进行外源蛋白表达。本专利技术的最后一个目的是提供一种生产几丁质结合蛋白CBP21或淬灭酶AIO6BS的方法。本专利技术提供的生产几丁质结合蛋白CBP21或淬灭酶AIO6BS的方法包括如下步骤：发酵培养上述重组菌，得到所述几丁质结合蛋白CBP21或淬灭酶AIO6BS。本专利技术基于基因工程技术和同源重组的原理，对胞内的质量控制体系的相关基因YmfH、YrrN、YrrO和YwpE进行了改造，分别构建了YmfH、YrrN、YrrO和YwpE基因的敲除载体，并分别把这些敲除载体导入枯草芽孢杆菌感受态细胞，分别获得了对应基因的缺失菌株，实现了在不同工程菌株中表达CBP21和AIO6BS蛋白。通过实验证明：胞内的质量控制体系的相关基因的失活，不同程度的影响了CBP21和AIO6BS的蛋白表达。说明对胞内质量控制体系相关因子的改造，有利于提高外源蛋白的合成、稳定折叠、分泌。同时本专利技术的一套胞内蛋白酶敲除的工程菌株，为研究胞内蛋白酶对外源蛋白的分泌表达的影响提供有效的工具，同时也为提高外源蛋白的产量和质量提供了一套工具。附图说明图1为蛋白酶基因扩增的电泳图。其中，M：MarkerGeneRuler1kbDNALadder；1为YmfH；2为YrrN；3为YrrO；4为YwpE。图2为蛋白酶基因连接T载体后扩增片段电泳图。其中，M：MarkerGeneRuler1kbDNALadder；1为YmfH；2为YrrN；3为YrrO；4为YwpE。图3为zeocin基因扩增的电泳图。其中，M：MarkerGeneRuler1kbDNALadder；第二泳道为zeocin基因。图4为蛋白酶敲除菌株的PCR鉴定。其中，M：MarkerGeneRuler1kbDNALadder。图5为SDS-PAGE检测不同蛋白酶敲除菌株的CBP21蛋白表达情况。其中，1为重组菌BS168ΔYmfHpWB980-CBP21，2为BS168ΔYrrNpWB980-CBP21，3为BS168ΔYrrOpWB980-CBP21，4为BS168ΔYwpEpWB980-CBP21，5为对照菌株(WT-CBP21)，6为对照菌株(空载体)。图6为SDS-PAGE和Westernblotting检测不同蛋白酶敲除菌株的AIO6BS蛋白表达情况。其中，1为重组菌BS168ΔYmfHpWB980-AIO6BS，2为BS168ΔYrrNpWB980-AIO6BS，3为BS168ΔYrrOpWB980-AIO6BS，4为BS168ΔYwpEpWB980-AIO6BS，5为对照菌株(WT-AIO6BS)，6为对照菌株(空载体)。具体实施方式下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。下述实施例中的10×最低盐溶液：K2HPO428g、KH2PO412g、(NH4)2SO44g、柠檬酸钠(2H2O)2g、MgSO47H2O0.4g，在蒸馏水中依次溶解，加水至200ml。下述实施例中的色氨酸溶液：2mg/ml，贮于棕色内，115℃灭菌30min，用黑纸或铝箔纸包裹。下述实施例中的GMI溶液：1×最低盐溶液94ml，灭菌后，补加25％葡萄糖2ml，5％水解酪蛋白0.4ml、10％酵母汁1ml、2mg/ml色氨基酸溶液2.5ml。下述实施例中的GMII溶液：1×最低盐溶液96.5ml，灭菌后，补加25％葡萄糖1ml，5％水解酪蛋白0.08ml、10％酵母汁本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组菌，为如下(1)或(2)：(1)所示的重组菌为降低和/或抑制枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白活性得到的菌；(2)所示的重组菌为降低和/或抑制枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白活性得到的菌。

【技术特征摘要】
1.一种重组菌，为如下(1)或(2)：(1)所示的重组菌为降低和/或抑制枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白活性得到的菌；(2)所示的重组菌为降低和/或抑制枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白活性得到的菌。2.根据权利要求1所述的重组菌，其特征在于：所述降低和/或抑制枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白活性为抑制或沉默枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因的表达；所述抑制或沉默枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因的表达具体为敲除枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因或其部分片段；所述降低和/或抑制枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白活性为抑制或沉默枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因的表达；所述抑制或沉默枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因的表达具体为敲除枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因或其部分片段。3.根据权利要求2所述的重组菌，其特征在于：所述敲除枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因或其部分片段为将枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因替换为抗性基因；所述敲除枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因或其部分片段为将枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因替换为抗性基因；所述将枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因替换为抗性基因和所述将枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因替换为抗性基因采用基因组定点编辑或同源重组的方式进行；所述基因组定点编辑具体为ZFN编辑、TALEN编辑或CRISPR/Cas9编辑；所述同源重组具体为λ-red同源重组或sacB基因介导筛选的同源重组或自杀质粒介导的同源重组。4.根据权利要求3所述的重组菌，其特征在于：所述将枯草芽孢杆菌中YrrN蛋白编码基因替换为抗性基因和所述将枯草芽孢杆菌中YwpE蛋白编码基因替换为抗性基...

【专利技术属性】
技术研发人员：周志刚，潘兴亮，杨雅麟，李志敏，李娟，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11