一种制备含表面素饲料添加剂的方法技术

本发明专利技术公开了一种制备含表面素生物饲料添加剂的方法，该方法是利用具高表面素(surfactin)产量的枯草芽孢杆菌突变株(B.S.surfactin 1)，以黄豆作为基质进行半固态发酵，再将发酵后的黄豆经过干燥与粉碎成为一黄豆粉后，即得一含有表面素的饲料添加剂；其中每公斤发酵黄豆粉中含有表面素约6-7g。本发明专利技术发现喂食含有表面素的饲料添加剂的石斑鱼，其生长速率较快、免疫型基因的表达量较高(如：AMP、Mx与IFN-induced protein)且感染病菌的鱼类，其死亡率大幅下降，显示该含表面素的饲料添加剂具有促进生长、增加免疫力与抵抗病源菌的感染的效果。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于农业领域中的水产养殖
和生物
，涉及一种利用枯草芽孢杆菌制备的微生物脂肽-表面素(surfactin)的生产方法及其在水产饲料中的应用。
技术介绍
枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)生产的二次代谢产物有β-内酰胺(β-lactams)、胺基糖苷(aminoglycoside)、聚乙酰胺衍生物(polyketides)和小型多胜肽(smallpolypeptides)，其中以脂肽与脂蛋白类(lipopeptidesandlipoproteins)较受到瞩目，因为脂肽与脂蛋白类具有抗菌效果，又被称为抗菌胜肽(AntimicrobialPeptide，AMP)。目前发现的抗菌胜肽可分为三家族，其一为丰原素(Fengycin)，分子中由十个胺基酸分子组成环状胜肽链，在胜肽链N端接上14到18个不等的脂肪酸支链，具有良好的抗真菌能力，但对于酵母菌与细菌没有明显的效果(Schneideretal.,1999)；另一个为伊枯草芽孢杆菌素(Iturin)，含有七个α-胺基酸环接耦合至β-胺基酸与烷基链，在胜肽链上接有14到17个不等的脂肪酸支链，分子量大小约1044～1081kD，功能为对抗真菌及细菌，具有生物降解性、高表面活性与低毒性等优点(Bonmatin,Laprevote,&Peypoux,2003)；第三个则为本专利技术所探讨的表面素(Surfactin)，其含有7个环状胺基酸与13到16个不等的脂肪酸支链，枯草芽孢杆菌在生产表面素时，通常会伴随着一枯草芽孢杆菌素出现，当两种抗菌胜肽共同存在时，会因为混合微胞对细胞拥有高亲和力，使得红血球溶血率增加，因此也会增加抗真菌的活性(Feignier,Besson,&Michel,1995；RMaget-Dana,Thimon,Peypoux,&Ptak,1992；Sandrin,Peypoux,&Michel,1990)。Arima等人于1968年在枯草芽孢杆菌培养液中发现一个白色针状结晶，因其具有界面活性故将其命名为表面素(Kakinuma,Hori,Isono,Tamura,&Arima,1969)。在过去的研究指出，当在水中含有20μM的表面素，其可将水溶液的表面张力由72mN/m降至27mN/m，是目前发现界面活性最佳的生物界面活性剂(Arima,Kakinuma,&Tamura,1968)。表面素是一个环型的脂胜肽，其含有7个环状胺基酸与13到16个不等的脂肪酸支链(Kakinuma,Sugino,Isono,Tamura,&Arima,1969)。在溶液中，脂肪酸碳链呈疏水特性，而环状的胺基酸则为亲水端，胺基酸中的天门冬胺酸(asparticacid)及麸胺酸(glutamicacid)皆带负电，两个带负电的胺基酸会形成钳状，使表面素分子形成带负电的马鞍结构，属于阴离子生物界面活性剂的一员(Tsan,Volpon,Besson,&Lancelin,2007)，根据胺基酸序列的不同，可将表面素分四种类型：A、B、C、D。其主要差别在于环状胺基酸后所接的脂肪酸碳链数的不同(Shaligram&Singhal,2010；Singh&Cameotra,2004)。由于表面素的非专一性的生物活性，使它可以藉由降低表面张力来破坏细菌的细胞膜，且不会造成抗药性，因此被认为具有抗菌的潜力，而被归类为抗菌脂肽的一员(Cho,Lee,Cha,Kim,&Shin,2003)。在过去的研究指出表面素可以抑制真菌、霉浆菌、格兰氏阴性菌与革兰氏阳性菌的生长(P.Das,Mukherjee,&Sen,2008；Singh&Cameotra,2004)；Heiko等人发现当表面素浓度在12～50μg/ml即具有杀菌能力(Heerklotz&Seelig,2001)；海洋中的Bacilluscirculans所产生的脂肽生物界面活性剂(lipopeptidebiosurfactant)，对于少数的抗多种药物菌株(multidrug-resistantstrain，MDR)以及抗青霉素金黄色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)具有抑制的效果(Panetal.,2007)；表面素也具有抗霉浆菌的特性，可恢复被霉浆菌污染的细胞的型态特征，且对于细胞新陈代谢和增殖不会产生伤害(Vollenbroich,Pauli,Ozel,&Vater,1997)；经由电子显微镜发现表面素会使霉浆菌的膜形成穿孔现象，此时会导致霉浆菌内外渗透压不平衡而死亡(RégineMaget-Dana&Ptak,1995)。目前的研究认为表面素的抗病毒机制是藉由病毒的脂质外套膜和表面素的物理化学作用后，造成病毒外套膜及蛋白质外壳结构崩裂，并且抑制病毒核酸物质进行复制(Vollenbroich,,Vater,Kamp,&Pauli,1997)。过去研究指出表面素能对抗好几种病毒，包括人类后天免疫不全病毒(HumanImmunodeficiencyVirus，HIV)、猪疱疹病毒第一型(SuidHerpesvirustype1，SHV-1)、单纯疱疹病毒第一型(HerpesSimplexVirus1，HSV-2)、滤泡性口炎病毒(VesicularStomatitisVirus，VSV)、猿猴免疫缺陷病毒(SimianImmunodeficiencyVirus，SIV)、猫流感病毒(FelineCalicivirus，FCV)、鼠脑心肌炎病毒(MurineEncephalomyocarditisVirus，MECV)、伪狂犬病毒(PseudorabiesVirus，PRV)、猪细小病毒(PorcineParvovirus，PPV)、新城鸡瘟病毒(NewcastleDiseaseVirus，NDV)、传染性法式囊症病毒(InfectiousBursalDiseaseVirus，IBDV)(Huangetal.,2006；Itokawaetal.,1994；Vollenbroich,,etal.,1997)。抗生素抗菌机制是抗生素与病原体特定部位的受体结合，使病原体的正常架构遭到破坏或阻碍某些生物合成，以达到抑菌或杀菌的作用。目前有研究朝着抗菌胜肽的角度来探讨表面素，由于表面素和抗菌胜肽皆为两性分子，但表面素的结构为环型，而抗菌胜肽依据结构的不同，分为四类：α-helix,β-sheet,β-turnloop,Boat-shaped。抗菌胜肽与细胞膜作用机制是利用胜肽脂质交互作用(Peptide-lipidinteraction)，分为四个模式：聚集模式(Aggregatemodel)、环形孔洞模式(Toroidalporemodel)、筒状穿凿式(Barrel-Stavemodel)及地毯覆盖式(Carpetmodel)，其中这些作用模式大多是经由胜肽脂质的交互作用，造成膜内外渗透压不平衡，使菌体死亡。目前表面素与细胞膜之间的作用机制尚无定本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种制备含表面素的饲料添加剂的方法，该方法包括以下步骤：A、将高产表面素的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)突变株的菌液接种至无机盐液体培养基与黄豆的混合物中，进行半固态发酵，得到一发酵过的黄豆，其中，所述的高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株，命名为B.S.surfactin 1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCCNo.10270；B、将该发酵过的黄豆烘干、磨碎与过筛，得到一黄豆粉末；该黄豆粉末即为含有表面素(surfactin)的饲料添加剂。

【技术特征摘要】
1.一种制备含表面素的饲料添加剂的方法，该方法包括以下步骤：A、将高产表面素的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)突变株的菌液接种至无机盐液体培养基与黄豆的混合物中，进行半固态发酵，得到一发酵过的黄豆，其中，所述的高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株，命名为B.S.surfactin1，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCCNo.10270；B、将该发酵过的黄豆烘干、磨碎与过筛，得到一黄豆粉末；该黄豆粉末即为含有表面素(surfactin)的饲料添加剂。2.如权利要求1所述的制备含表面素的饲料添加剂的方法，其中步骤A的高产表面素的枯草芽孢杆菌突变株的菌液的接种体积与该混合物中黄豆体积的比例为5:100-10:100。3.如权利要求1的制备含表面素的饲料添加剂的方法，其中步骤A中无机盐液体培养基的体积与该混合物中黄豆体积的比例为25:100-35:100。4.如权利要求1所述的制备含表面素的饲料添加剂的方法，其中步...

【专利技术属性】
技术研发人员：陆振冈，
申请(专利权)人：南京莎菲特生物科技有限公司，陆振冈，
类型：发明
国别省市：江苏;32