一种检测血清中甘胆酸含量的试剂盒及其制备方法技术

技术编号:14363360 阅读:118 留言:0更新日期:2017-01-09 10:48
本发明专利技术公开了一种检测血清中甘胆酸含量的试剂盒,包括抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、校准品、质控品、发光底物液和浓缩洗液;抗试剂A是碱性磷酸酶标记的甘胆酸衍生物抗试剂A;抗试剂B是FITC标记的甘胆酸抗体,磁微粒试剂是包被有FITC抗体的羧基磁微粒混同时还公开了该试剂盒的制备方法。该试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合,提供了一种接近均相的反应体系,并且采用了一步法反应模式,使得检测性能大大提高(灵敏度、精密性、检测范围等),反应时间大大缩短,从开始加样到检测结果,时间少于35min,明显快于同类试剂盒);偶联效率高,结合牢固,且工艺稳定,在提高产品性能的同时,大大降低了产品成本。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物化学
,具体涉及一种采用免疫竞争法、磁微粒化学发光法测定人体中甘胆酸(CG)含量的试剂盒。
技术介绍
甘胆酸(Cholyglycine,CG),是由胆酸和甘氨酸结合而成的结合型胆酸,是胆汁酸的主要成分之一。胆固醇在肝细胞内经过极其复杂的酶促反应,转变成初级胆汁酸,包含胆酸(CA)和鹅去氧胆酸(CDCA)。当肝细胞受损伤,肝有疾病时,就引起甘胆酸代谢和循环紊乱,血清中的肝胆酸量就增加,且较ALT、AST、总胆红素(TBIL)、碱性磷酸酶(ALP)、谷酰转肽酶(GGT)及血清白蛋白(ALB)等常规肝功能指标更为敏感。各种肝脏疾病如:肝癌、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎等患者的甘胆酸水平均显著升高,因此甘胆酸可作为诊断这些疾病的良好指标。同时甘胆酸的检测对孕妇妊娠期肝内胆汁淤积症(ICP)的诊断具有重要的临床意义。目前已知的甘胆酸测定方法有放射免疫法(RIA)、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶乳增强比浊法等。放射免疫法步骤繁琐,试剂价格昂贵,需使用配套的仪器且存在放射性污染。酶联免疫吸附法存在检测时间长、操作复杂、重复性差、不适于急诊和临床病人及时诊断的需要。胶乳增强免疫比浊法操作简单、快速,但是灵敏度低、低值重复性差。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷,提供一种检测血清中甘胆酸含量的试剂盒,为了解决上述技术问题,本专利技术提供了如下的技术方案:本专利技术的试剂盒包括抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、校准品、质控品、发光底物液和浓缩洗液;其中,所述抗试剂A是碱性磷酸酶标记的甘胆酸衍生物,含BSA的抗试剂A缓冲液;所述碱性磷酸酶标记的甘胆酸衍生物是通过偶联剂将甘胆酸衍生物和碱性磷酸酶偶联后获得,浓度为0.8ug/mL;所述抗试剂A缓冲液为10~100mM的Tris-HCl溶液,pH值为7-8,含有浓度为2-6wt%的PEG-6000、0.7-0.9wt%的氯化钠、0.05-0.1wt%的叠氮钠、0.3wt%的PC-300、0.1-1wt%牛血清白蛋白以及20mMEDTA;所述抗试剂B是FITC标记的甘胆酸抗体,含BSA的抗试剂B缓冲液;所述FITC标记的甘胆酸抗体是通过偶联剂将甘胆酸抗体和FITC偶联后获得;所述抗试剂A缓冲液为10~100mM的Tris-HCl溶液,pH值为7-8,0.12wt%的ANS、2-6wt%的PEG-6000、0.7-0.9wt%的氯化钠、0.05-0.1wt%的叠氮钠、0.3wt%的PC-300、0.1-1wt%牛血清白蛋白以及20mMEDTA;所述磁微粒试剂是包被有FITC抗体的羧基磁微粒混悬液;所述校准品和质控品由人源性甘胆酸和缓冲液组成,缓冲液为浓度50-200mM的Tris-HCl溶液,含有浓度为0.1~1wt%的牛血清白蛋白、0.05~0.5wt%的PC-300、5~50mM的乙二胺四乙酸二钠;所述发光底物液是含有AMPPD的Tris-HCl溶液,所述Tris-HCl溶液的pH值为8.0~10.0,含有浓度20V%的AMPPD、16wt%的NaCl、0.4wt%的KCl和2.42wt%的Tris;进一步的,所述偶联剂选自碳化二亚胺、戊二醛、二异氰酸化合物或二卤化二硝基苯中的一种或多种。进一步的,所述FITC抗体选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白和血蓝蛋白中的一种或多种。进一步的,所述羧基磁微粒为核壳结构,直径范围为100~4500nm,浓度为1~5mg/mL;所述羧基磁微粒的表面带有由羧基、氨基、羟基、酰肼基或氯甲基的一种或多种修饰的化学基团;所述FITC抗体通过羧基磁微粒携带的基团键合在羧基磁微粒表面。进一步的,所述浓缩洗涤液是含有吐温20的Tris-HCl溶液,pH值为7.4,含有浓度16wt%的NaCl、0.4wt%的KCl、2.42wt%的Tris,使用时用双蒸水15倍稀释。本专利技术的试剂盒的制备方法,包括如下步骤:一、磁微粒试剂的制备:1)、将羧基磁微粒用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)在pH4.5~pH5.5下进行活化,然后在磁场上静置使羧基磁微粒与液体分开,弃去上清;2)用pH7.6的0.01M的PBS缓冲液洗去多余化活化剂,然后加入适量的FITC抗体,使FITC抗体的浓度为0.5ul/mg,在pH7.4~pH7.8下震荡反应;3)反应结束后在磁场上静置使羧基磁微粒与液体分开,弃去上清,用含有1wt%牛血清白蛋白的0.01M的PBS缓冲液进行封闭;4)封闭结束后,加入封闭液以保存磁微粒试剂,使包被有FITC抗体的羧基磁微粒的最终浓度为2mg/mL;该磁微粒混悬液置于2-8℃保存,以备使用;二、抗试剂A的制备甘胆酸衍生物的制备使用SMCC活化剂将甘胆酸进行活化,生成马来酰亚胺-甘胆酸衍生物;马来酰亚胺-甘胆酸衍生物含有可以与-SH基团反应的马来酰亚胺基团,加入含有-SH的碱性磷酸酶,将CG衍生物与碱性磷酸酶连接在一起;抗试剂A缓冲液的制备将9gNaCl、0.5g叠氮钠、3gPC-300、10g牛血清白蛋白和5.84gEDTA溶于900mL双蒸水中,用HCl调整PH7.0-8.0,用双蒸水定容至1000mL;三、抗试剂B的制备将1.2gANS、9gNaCl、0.5g叠氮钠、3gPC-300、10g牛血清白蛋白和5.84gEDTA溶于900mL双蒸水中,用HCl调整pH7.0~8.0,用双蒸水定容至1000mL,获得含BSA的缓冲液;在BSA缓冲液中,25℃条件下,FITC与甘胆酸抗体产生偶联反应,经过蛋白纯化仪纯化,收集包被有FITC的甘胆酸抗体,经过紫外分光光度计检测包被有FITC的甘胆酸抗体的浓度,调整至工作浓度为1.4ug/mL;四、校准品和质控品的制备用含有终浓度0.1-1wt%的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt%的PC-300、5-50mM的乙二胺四乙酸二钠的BSA缓冲液将人源性甘胆酸纯品配制成浓度为0ug/mL、1ug/mL、2.5ug/mL、10ug/mL、20ug/mL、40ug/mL的一系列校准品;用含有终浓度0.1-1wt%的牛血清白蛋白、0.05-0.5wt%的PC-300、5-50mM的乙二胺四乙酸二钠的BSA缓冲液将人源性甘胆酸纯品配制成浓度为2.5ug/mL、20ug/mL的质控品;五、发光底物液的制备将200mLAMPPD、160gNaCl、4gKCl、24.2g三羟甲基氨基甲烷溶于900mL双蒸水中,用HCl调整PH8.0~10.0,用双蒸水定容至1000mL;六、浓缩洗涤液的制备将160NaCl、4gKCl、24.2g三羟甲基氨基甲烷、1mL吐温20溶于900mL双蒸水中,用HCl调整至PH7.4,用双蒸水定容至1000mL,使用时用双蒸水15倍稀释。本专利技术的技术原理如下:异硫氰酸荧光素(FITC)标记的甘胆酸抗体与碱性磷酸酶(AP)标记的甘胆酸配对抗体和样本、校准品或质控品中的甘胆酸结合形成“三明治”复合物。随后加入连有抗FITC抗体的磁微粒,通过抗FITC抗体与FITC的特异性结合使抗原抗体免疫复合物结合在磁微粒上。在外加磁场的作用下,将免疫反应形成的复合物与未结合的其他物质分离,清洗复合物后,加入酶促化学发本文档来自技高网...
一种<a href="http://www.xjishu.com/zhuanli/52/201610663497.html" title="一种检测血清中甘胆酸含量的试剂盒及其制备方法原文来自X技术">检测血清中甘胆酸含量的试剂盒及其制备方法</a>

【技术保护点】
一种检测血清中甘胆酸含量的试剂盒,其特征在于,包括:抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、校准品、质控品、发光底物液;其中,所述抗试剂A是碱性磷酸酶标记的甘胆酸衍生物,含BSA的抗试剂A缓冲液;所述碱性磷酸酶标记的甘胆酸衍生物是通过偶联剂将甘胆酸衍生物和碱性磷酸酶偶联后获得,浓度为0.8ug/mL;所述抗试剂A缓冲液为10~100mM的Tris‑HCl溶液,pH值为7‑8,含有浓度为2‑6wt%的PEG‑6000、0.7‑0.9wt%的氯化钠、0.05‑0.1wt%的叠氮钠、0.3wt%的PC‑300、0.1‑1wt%牛血清白蛋白以及20mMEDTA;所述抗试剂B是FITC标记的甘胆酸抗体,含BSA的抗试剂B缓冲液;所述FITC标记的甘胆酸抗体是通过偶联剂将甘胆酸抗体和FITC偶联后获得;所述抗试剂A缓冲液为10~100mM的Tris‑HCl溶液,pH值为7‑8,0.12wt%的ANS、2‑6wt%的PEG‑6000、0.7‑0.9wt%的氯化钠、0.05‑0.1wt%的叠氮钠、0.3wt%的PC‑300、0.1‑1wt%牛血清白蛋白以及20mM EDTA;所述磁微粒试剂是包被有FITC抗体的羧基磁微粒混悬液;所述校准品和质控品由人源性甘胆酸和缓冲液组成,缓冲液为浓度50‑200mM的Tris‑HCl溶液,含有浓度为0.1~1wt%的牛血清白蛋白、0.05~0.5wt%的PC‑300、5~50mM的乙二胺四乙酸二钠;所述发光底物液是含有AMPPD的Tris‑HCl溶液,所述Tris‑HCl溶液的pH值为8.0~10.0,含有浓度20V%的AMPPD、16wt%的NaCl、0.4wt%的KCl和2.42wt%的Tris。...

【技术特征摘要】
1.一种检测血清中甘胆酸含量的试剂盒,其特征在于,包括:抗试剂A、抗试剂B、磁微粒试剂、校准品、质控品、发光底物液;其中,所述抗试剂A是碱性磷酸酶标记的甘胆酸衍生物,含BSA的抗试剂A缓冲液;所述碱性磷酸酶标记的甘胆酸衍生物是通过偶联剂将甘胆酸衍生物和碱性磷酸酶偶联后获得,浓度为0.8ug/mL;所述抗试剂A缓冲液为10~100mM的Tris-HCl溶液,pH值为7-8,含有浓度为2-6wt%的PEG-6000、0.7-0.9wt%的氯化钠、0.05-0.1wt%的叠氮钠、0.3wt%的PC-300、0.1-1wt%牛血清白蛋白以及20mMEDTA;所述抗试剂B是FITC标记的甘胆酸抗体,含BSA的抗试剂B缓冲液;所述FITC标记的甘胆酸抗体是通过偶联剂将甘胆酸抗体和FITC偶联后获得;所述抗试剂A缓冲液为10~100mM的Tris-HCl溶液,pH值为7-8,0.12wt%的ANS、2-6wt%的PEG-6000、0.7-0.9wt%的氯化钠、0.05-0.1wt%的叠氮钠、0.3wt%的PC-300、0.1-1wt%牛血清白蛋白以及20mMEDTA;所述磁微粒试剂是包被有FITC抗体的羧基磁微粒混悬液;所述校准品和质控品由人源性甘胆酸和缓冲液组成,缓冲液为浓度50-200mM的Tris-HCl溶液,含有浓度为0.1~1wt%的牛血清白蛋白、0.05~0.5wt%的PC-300、5~50mM的乙二胺四乙酸二钠;所述发光底物液是含有AMPPD的Tris-HCl溶液,所述Tris-HCl溶液的pH值为8.0~10.0,含有浓度20V%的AMPPD、16wt%的NaCl、0.4wt%的KCl和2.42wt%的Tris。2.根据权利要求1所述的检测血清中甘胆酸含量的试剂盒,其特征在于,所述偶联剂选自碳化二亚胺、戊二醛、二异氰酸化合物或二卤化二硝基苯中的一种或多种。3.根据权利要求3所述的检测血清中甘胆酸含量的试剂盒,其特征在于,所述FITC抗体选自人血清白蛋白、牛血清白蛋白、牛转铁蛋白和血蓝蛋白中的一种或多种。4.根据权利要求1所述的检测血清中甘胆酸含量的试剂盒,其特征在于,所述羧基磁微粒为核壳结构,直径范围为100~4500nm,浓度为1~5mg/mL;所述羧基磁微粒的表面带有由羧基、氨基、羟基、酰肼基或氯甲基的一种或多种修饰的化学基团;所述FITC抗体通过羧基磁微粒携带的基团键合在羧基磁微粒表面。5.根据权利要求1-4任一项所述的检测血清中甘胆酸含量的试剂盒,其特征在于,还包括浓缩洗涤液,所述浓缩洗涤液是含有吐温20的Tris-HCl溶液,pH值为7.4,含有浓度16wt%的NaCl、0.4wt%的KCl、2.42wt%的Tris,使用时用双蒸水15倍稀释。6.如权利要求5所述的检测血清中甘胆酸含量的试剂盒的制备方法,其特征在于,包括如下步...

【专利技术属性】
技术研发人员:季连星刘振国王赟孙裔雷孔晓凯丁文健夏振伟
申请(专利权)人:泰州泽成生物技术有限公司
类型:发明
国别省市:江苏;32

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