本发明专利技术公开了一株通过细胞低温传代和药物筛选致弱的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株及其应用。该弱毒疫苗株是在一株猪伪狂犬病病毒变异株(命名为HeN1株，其微生物保藏编号为CGMCC NO.6656)的基础上，首先通过在Vero细胞上低温传代筛选获得了在US区存在包括gI、gE、Us9、Us2及部分反向重复序列在内的大片段缺失的病毒，然后进一步通过药物筛选致使其TK基因部分缺失。该基因缺失弱毒疫苗株命名为PRV TP株，其微生物保藏编号为CGMCC NO.12300。本发明专利技术的弱毒疫苗株可制备成活疫苗或灭活疫苗(单苗或联苗)等，都可有效预防猪伪狂犬病，也可将其制备成诊断或治疗猪伪狂犬病的试剂。本发明专利技术的猪伪狂犬病弱毒疫苗株PRV TP株具有安全性好、保护效率高、利于鉴别诊断等优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一株猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株，还涉及该疫苗株在预防及治疗猪伪狂犬病中的应用，本专利技术属于医药
技术介绍
猪伪狂犬病(PorcinePseudorabies,PR)是由猪伪狂犬病病毒(PorcinePseudorabiesVirus,PRV)引起的一种急性传染病。哺乳仔猪感染伪狂犬病毒均出现发热及神经症状，死亡率几乎高达100％。一般情况下，成年猪感染不会出现明显发病现象，仅见打喷嚏、咳嗽、体温升高等轻微症状；妊娠母猪感染伪狂犬病病毒可导致出现流产、死胎、产弱仔和木乃伊胎；公猪感染可引起睾丸鞘膜炎。该病具有高度的传染性，极易通过空气、接触经呼吸道传播。伪狂犬病是规模化猪场的常规免疫防控对象，一直得到了很好的控制。预防猪伪狂犬病的疫苗主要有自然缺失弱毒疫苗和基因工程缺失疫苗，目前在市场上广泛使用是自然缺失弱毒疫苗。自然缺失弱毒疫苗是通过非猪源细胞或鸡胚的连续传代，或在某些诱变剂的存在下，用低于或高于通常的培养温度在细胞培养物上连续传代获得,其基因组的内部存在着多处的点突变以及一些基因的缺失，它是一种自然的基因缺失疫苗。从20世纪60年代开始，一些国家用不同的方法培育了几株伪狂犬病弱毒疫苗株，有匈牙利的Bartha株(BarthaK61株)；罗马尼亚的Bucharest株、TK200株和BUK株；北爱尔兰的NFA-4株；保加利亚的MK25株；法国的Alfolt-26株；前苏联的VAGK-2株等，其中在国内广泛使用的是BarthaK61株。但2011年下半年以来，有多个使用常规疫苗免疫的规模化猪场出现了疑似伪狂犬病流行的现象。我们从现地分离到病毒，命名为PRVHeN1株，通过血清中和试验和绵羊的免疫接种试验证实，在国内广泛使用的PRV疫苗株BarthaK61株免疫猪产生的中和抗体不能有效中和新分离的病毒PRVHeN1株，而且免疫BarthaK61的绵羊也不能完全抵抗PRVHeN1株的攻击。gE基因的序列分析表明，2012年分离的新流行毒株之间同源性很高，与以往发表的国内外gE基因序列相比处于一个相对独立的分支中，证实新流行毒株为PRV变异株，因此急需开发新的安全有效的PRV疫苗以应对新流行的毒株。
技术实现思路
本专利技术的目的之一是提供一株猪伪狂犬病弱毒疫苗株，用该弱毒疫苗株所制备的疫苗对于PRV变异株具有良好的保护效力。本专利技术的目的之二是提供一种预防或诊断及治疗猪伪狂犬病的疫苗组合物或试剂。本专利技术的上述目的分别是通过以下技术方案来实现的：本专利技术利用一株分离自发病猪体的PRV变异株HeN1株(微生物保藏编号为CGMCCNO.6656，已记载在公开号为CN102994458A，公开日为2014-04-02，专利技术名称为“猪伪狂犬病病毒强毒株、其基因缺失疫苗株及其应用”的专利申请中)，首先通过在Vero细胞上低温传代筛选获得了在US区存在包括gI、gE、Us9、Us2和部分反向重复序列在内的大片段缺失的病毒，然后进一步通过药物筛选致使其TK基因部分缺失。该基因缺失毒株命名为PRVTP株，与现有文献报道的PRV基因缺失株的缺失位置存在差异。利用对PRV敏感的小鼠、绵羊对其安全性进行了评价，结果表明PRVTP株对小鼠的半数致死量(LD50)为105.17TCID50，而本实验室之前构建的基因工程缺失毒rPRV-gE--EGFP+(微生物保藏编号为CGMCCNO.6657，已记载在公开号为CN102994458A，公开日为2014-04-02，专利技术名称为“猪伪狂犬病病毒强毒株、其基因缺失疫苗株及其应用”的专利申请中)对小鼠的LD50为103.32TCID50。6-8月龄绵羊接种107.0TCID50的PRVTP株不引起发病和死亡，而接种106.0TCID50的rPRV-gE--EGFP+毒株可导致部分羊发病和死亡，说明PRVTP株比rPRV-gE--EGFP+毒株具有更高的安全性。将PRVTP株免疫仔猪可以提供对PRV变异株(PRVHeN1株)的完全保护，而现在广泛使用的BarthaK61株仅能提供对变异株的部分保护。上述结果表明本专利技术中获得的基因缺失病毒是一株具有良好安全性和免疫保护效力的弱毒株，可以作为弱毒疫苗使用。本专利技术通过细胞低温传代和药物筛选致弱获得的一株猪伪狂犬病病毒(PorcinePseudorabiesVirus，PRV)基因缺失弱毒疫苗株，其特征在于：在其UL区的TK基因存在独有的716bp缺失，TK基因的具体缺失位置为nt59391-60106，参照亲本毒基因组序列GenBank登录号为KP098534.1，缺失后TK基因核苷酸序列为SEQIDNO:1所示。如本专利技术所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株，其特征在于：其US区存在包括gI、gE、Us9、Us2及部分反向重复序列在内的大片段缺失，US区具体的缺失位置为nt121392-126327，参照亲本毒基因组序列GenBank登录号为KP098534.1，缺失后的部分Us区核苷酸序列如SEQIDNO:2所示。如本专利技术所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株，其特征在于：其gC基因及其侧翼序列为SEQIDNO:3所示。在本专利技术中，所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株，命名为PRVTP，分类命名为伪狂犬病病毒，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址在北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，其微生物保藏号是：CGMCCNo.12300，保藏时间为2016年5月25日。进一步的，本专利技术还提出了一种用于治疗或预防猪伪狂犬病的疫苗组合物，其由以上任一项所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株和药学上可接受的佐剂组成。更进一步的，本专利技术还提出了所述的猪伪狂犬病病毒疫苗株在制备预防或治疗猪伪狂犬病药物中的用途。以及所述的猪伪狂犬病病毒疫苗株在制备诊断或检测猪伪狂犬病试剂中的用途。本专利技术的弱毒疫苗株可制备成活疫苗或灭活疫苗(单苗或联苗)等，都可有效预防猪伪狂犬病，也可将其制备成诊断或检测猪伪狂犬病的试剂。本专利技术的猪伪狂犬病弱毒疫苗株PRVTP株具有安全性好、保护效率高、利于鉴别诊断等优点。附图说明图1为PRVHeN1F135代噬斑克隆的PCR鉴定结果；注：23号克隆为阴性；图2为TK基因部分缺失毒株的PCR筛选结果；注：以TKup2/TKLow2为引物，预计扩增产物大小为1406bp，3号克隆扩增大小为690bp；图3为PRVTP株Us区缺失片段的PCR鉴定结果；注：每组PCR产物上样顺序为(模板)HeN1F5代、TP株、阴性对照；图4为PRVTP株US区具体缺失位置的PCR鉴定结果；注：以HeU121353/HeL126636为引物扩增TP株基因组，上样顺序为水对照、TP株，TP株扩增出大小约为500bp的片段；图5为不同PRV毒株gC基因的PCR鉴定结果；注：1、2、3泳道为引物BarthagCup/BarthagCLow扩增产物，4、5、6泳道为引物HeN1gCup/HeN1gCLow扩增产物，上样顺序均为TP株、BarthaK61株及阴性对照；图6为PRVTP株与Bartha株gC基因特征性区域示意图。具体实施方式下面结合具体实施例来进一步描述本专利技术，本专利技术的优点和特点将会随着描述而更为本文档来自技高网...
【技术保护点】
一株猪伪狂犬病病毒(Porcine Pseudorabies Virus，PRV)基因缺失弱毒疫苗株，命名为PRV TP，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号是：CGMCC No.12300。
【技术特征摘要】
1.一株猪伪狂犬病病毒(PorcinePseudorabiesVirus，PRV)基因缺失弱毒疫苗株，命名为PRVTP，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其微生物保藏号是：CGMCCNo.12300。2.如权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株，其特征在于：在其UL区的TK基因存在独有的716bp缺失，TK基因的具体缺失位置为nt59391-60106，参照亲本毒基因组序列GenBank登录号为KP098534.1，缺失后TK基因核苷酸序列为SEQIDNO:1所示。3.如权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒基因缺失弱毒疫苗株，其特征在于：其US区存在包括gI、gE、Us9、Us2及部分反向重复序列在...
【专利技术属性】
技术研发人员：田志军，彭金美，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：黑龙江;23
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。