一种鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记制造技术

本发明专利技术公开了一种鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记。与phyB野生型及突变位点检测相关的标记，其核苷酸序列分别如Seq No.1‑2所示。利用引物PHYBF4/PHYBR1进行PCR扩增，扩增产物进行BamHⅠ酶切并进行电泳分析：如果PCR产物不能被BamHⅠ酶切，为175bp DNA片段，则为野生型phyB；如果能够被BamHⅠ酶切，酶切产物为25bp和151bp两条DNA片段的，则为突变体phyB1。本发明专利技术的分子标记具有扩增简单、快速，成本低的优势。该分子标记可以对phyB等位基因型进行有效、快速、可靠的鉴定，为后续将phyB突变体应用于育种群体筛选提供有力的工具。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记，属于植物生物

技术介绍
高等植物利用光敏色素(phytochromes)、隐花色素(cryptochromes)和向光素(phototropins)等光受体，感受其生长环境中光质、光强、光周期等条件的变化，调节自身的生长发育，以最大限度适应周围环境。其中，光敏色素主要感受红光(redlight,R)和远红光(far-redlight,FR)。水稻中光敏色素基因家族包括3个成员：PHYA、PHYB和PHYC。其中PHYB基因位于水稻的第3染色体短臂，为单拷贝。Takano等(2005)通过伽马射线诱导突变筛选得到了多个phyB突变体，分别命名为phyB1～phyB5。其中phyB1突变体在PHYB基因内部1644bp处插入一个碱基C，从而引起翻译提前终止(Takano等，2005，PlantCell,2005,17:3311-3325)。通过分析水稻光敏色素突变体的光形态建成特征，发现phyB在水稻生长发育和胁迫反应中具有重要作用。phyB突变体无论是长日照条件还是短日照条件下，开花期均明显提前(Takano等，2005，PlantCell,2005,17:3311-3325)；其干旱胁迫耐性也明显增强(Liu等，2012，PlantMolBiol.,78(3):289-300)；而且对于稻瘟病具有一定的抗性(Xie等，2011，Mol.Plant4(4):688-696)。而phyB突变体的株高，穗粒数，结实率等农艺性状与野生型水稻日本晴相比没有明显差异(Takano等，2005，PlantCell,2005,17:3311-3325)。因此phyB突变体可以作为一种重要的种质资源用于早熟、抗病、耐旱水稻品种培育。为了将phyB突变体更好的应用于育种中，开发一种简单方便的区分phyB突变体与其他常规水稻品种的分子标记，以实现phyB等位基因型的有效、可靠、快速鉴定，在后续利用phyB突变位点进行育种群体筛选中具有重要价值。虽然Takano等(2005)《DistinctandCooperativeFunctionsofPhytochromesA,B,andCintheControlofDeetiolationandFloweringinRice》(ThePlantCell,Vol.17,3311–3325)的文章中开发了一种鉴定phyB1突变体的分子标记，但是该标记扩增片段较大(1Kb)，GC含量较高，要用高GC的PCRbuffer进行扩增，而且PCR扩增时间较长，且用于酶切的限制性内切酶NlaIV属于罕见的限制性内切酶，购买困难，且价格昂贵(3.49元/U，NEB北京)，提高了鉴定成本，不适用于大规模的鉴定；经常出现没有库存、断货等现象，严重影响鉴定工作顺利进行。
技术实现思路
本专利技术的首要目的在于克服现有技术的不足，提供一种简单、有效、成本较低的鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记及引物。本专利技术的另一目的在于提供上述分子标记的应用。本专利技术的技术方案是：一种鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记，其特征是，与phyB野生型位点检测相关的核苷酸序列如下所示(SeqNo.1)：TGTCACACAAAGCCCCAGCATCATGGACCTTGTGAAGTGTGATGGTGCTGCTCTGTATTACCATGGGAAGTACTACCCTCTTGGTGTCACTCCCACAGAAGTTCAGATTAAGGACATCATCGAGTGGTTGACTATGTGCCATGGAGACTCCACAGGGCTCAGCACAGATAGCCTT。与phyB突变体位点检测相关的核苷酸序列如下所示(SeqNo.2)：TGTCACACAAAGCCCCAGCATCATGGACCCTTGTGAAGTGTGATGGTGCTGCTCTGTATTACCATGGGAAGTACTACCCTCTTGGTGTCACTCCCACAGAAGTTCAGATTAAGGACATCATCGAGTGGTTGACTATGTGCCATGGAGACTCCACAGGGCTCAGCACAGATAGCCTT。所述的光敏色素突变体phyB突变体为phyB1突变体。本专利技术还公开了一种用于鉴定上述水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记的引物，具体为：上游引物PHYBF4：5’-TGTCACACAAAGCCCCAGCATCATGGATC-3’(SeqNo.3)；下游引物PHYBR1：5’-AAGGCTATCTGTGCTGAGCC-3’(SeqNo.4)。所述的用于鉴定水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记在水稻种质资源鉴定或育种辅助选育中的应用。应用上述引物鉴定水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的方法，其特征是，包括以下步骤：(1)利用上游引物PHYBF4和下游引物PHYBR1对水稻基因组DNA进行PCR扩增；(2)对步骤(1)得到的PCR扩增产物进行电泳分析：如果PCR扩增产物大小为175bpDNA片段，则为野生型phyB；如果PCR扩增产物大小为176bpDNA片段，则为突变体phyB1；(3)对步骤(1)得到的PCR产物进行BamHⅠ酶切并进行电泳分析：如果PCR产物不能被BamHⅠ酶切，依然为175bpDNA片段，则为野生型phyB；如果PCR产物能够被BamHⅠ酶切，酶切产物为25bp和151bp两条DNA片段的，则为突变体phyB1。步骤(1)中所述的PCR扩增体系可以利用普通PCRbuffer进行扩增，也可以用PCRmix进行扩增，优选体系为20μL体系，用PCRmix进行扩增。本实验所用PCRmix为全式金公司2×EasyTaqPCRSuperMix(+dye)，PCR反应体系包括如下组分：步骤(1)所述的PCR扩增反应程序优选为：94℃预变性3min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，35个循环；72℃后延伸5min。上述水稻品系可以为日本晴(公开报道的一个品种)、新稻18(国审稻2008028)和临稻11(鲁农审字[2004]014号)等水稻品系。本专利技术相对于现有的技术具有如下的优点及效果：(1)开发了一种用于区分水稻光敏色素基因phyB突变体与其他常规水稻品种的分子标记引物PHYBF4/PHYBR1，从而对phyB等位基因型进行有效、快速、可靠的鉴定，为后续将phyB突变体应用于育种群体筛选提供有力工具。(2)本专利技术的功能标记引物PHYBF4/PHYBR1利用普通PCR技术，能够特异性的检测phyB突变体。与已有标记相比，本标记扩增更加简单、快速；PCR扩增程序时间(1h)远远低于原有标记的时间(2h)(Takano等，2005，PlantCell,2005,17:3311-3325)；PCR产物酶切所用的限制性内切酶BamHⅠ为分子生物学常用酶，各公司都常规备货不会出现因为断货导致实验中断现象；同时BamHⅠ的价格(0.0478元/U,NEB北京)远远低于NlaIV(3.49元/U,NEB北京)，大大降低成本。该标记可以对不同的水稻材料phyB1突变体等位基因进行基因分型，并可作为一种分子标记应用于育本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记，其特征是，与phyB野生型位点检测相关的标记，其核苷酸序列如Seq No.1所示；与phyB突变体位点检测相关的标记，其核苷酸序列如Seq No.2所示。

【技术特征摘要】
1.一种鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记，其特征是，与phyB野生型位点检测相关的标记，其核苷酸序列如SeqNo.1所示；与phyB突变体位点检测相关的标记，其核苷酸序列如SeqNo.2所示。2.如权利要求1所述的一种鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记，其特征是，所述phyB突变体为phyB1突变体。3.一种用于鉴别权利要求1或2所述的水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体的分子标记的引物，其特征是，所述引物为：上游引物PHYBF4：5’-TGTCACACAAAGCCCCAGCATCATGGATC-3’；下游引物PHYBR1：5’-AAGGCTATCTGTGCTGAGCC-3’。4.权利要求1所述的分子标记在鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体中的应用。5.权利要求1所述的分子标记在水稻种质资源鉴定或育种辅助选育中的应用。6.权利要求3所述的引物在鉴别水稻光敏色素基因PHYB野生型和突变体中的应用。7.权利要求6所述的应用方法，其特征是，(1)利用上游引物PHYBF4和下游引物PHYBR1对水稻基因组DNA进行PCR扩增；(2)对步骤(1)得到的PCR扩...

【专利技术属性】
技术研发人员：郑崇珂，谢先芝，周晋军，白波，和亚男，孙伟，解丽霞，
申请(专利权)人：山东省水稻研究所，
类型：发明
国别省市：山东;37