一种大肠杆菌外膜蛋白疫苗的制备方法技术

本发明专利技术涉及一种大肠杆菌外膜蛋白BamA的制备方法及其应用。培养大肠杆菌菌株并提取其DNA，设计大肠杆菌外膜蛋白表面抗原区域(Bac_surface_Ag，rBamA，第448～810位氨基酸)基因序列的引物对，以大肠杆菌基因组DNA为模板进行PCR扩增。PCR产物和载体pET-28a(+)连接并转化E.coli BL21感受态细胞中，采取IPTG诱导的方法，诱导大肠杆菌外膜蛋白rBamA表达。经过纯化最终得到重组的大肠杆菌外膜蛋白rBamA。该重组外膜蛋白具有一定的免疫原性及抗原性，能够有效抵抗大肠杆菌的感染，以及大肠杆菌所引起的疾病。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白质工程和基因工程领域，尤其涉及一种大肠杆菌重组外膜蛋白rBamA的制备方法及其免疫保护功能的应用。
技术介绍
1)大肠杆菌(Escheriacoli，E.coli)，又称大肠埃希氏菌，又广泛存在于生物体内，包括植物，人及其它温血动物体内。大多数大肠杆菌正常栖居条件下不致病，但若进入胆囊、膀胱等处可引起炎症。在肠道内大量繁殖，常随粪便散布在周围环境中。同时，一些携带致病性因子(如肠毒素)的大肠杆菌能引起健康动物发病，如肠道腹泻型，尿路感染型，败血症及脑膜炎等疾病。目前，针对革兰氏阴性细菌的防治手段是利用抗生素和疫苗接种。然而抗生素的长期大量使用大大加速了致病菌耐抗药性的进化。随着抗菌药物在兽医临床和畜牧养殖业中的广泛应用，及耐药性质粒在肠杆菌之间的转移，致病性大肠杆菌对许多抗菌药物的敏感性逐渐降低，耐药性菌株越来越多。各地和不同动物的分离株对抗菌药物的耐药性差别很大，因此很难确定一个能够普遍适用的药物敏感谱。根据监测的情况，对庆大霉素、丁胺卡那霉素及痢特灵的抗生素敏感的菌株比例较高。越来越多的耐药性菌株不断出现。抗生素滥用引起的耐药性问题及抗生素残留问题已经是一个全球性亟需解决的问题，减少抗生素的使用是一个艰难但必须实施的方案。改善动物养殖条件，接种疫苗预防病原菌是减少抗生素使用的有效途径。畜禽大肠杆菌病原菌的血清型很多，不同地区可能存在不同的优势血清群：据文献报道，大肠杆菌菌体O抗原171种，荚膜K抗原103种，鞭毛H抗原56种，这些抗原可组合成大量抗原性不同的血清型。但是，研究发现不同血清型之间抗原交叉保护力非常弱，目前尚不可能制备一种覆盖所有血清型的超广谱疫苗。此外，我国不同地区优势血清群差异的存在导致未能像国外那样通过开发包括优势血清群抗原的疫苗就可达到理想的免疫效果。因此，畜禽大肠杆菌疫苗在我国应用存在较大的局限性。目前疫苗主要为单一血清型或单一致病型，虽然部分疫苗对本血清型或本致病型菌株具有较好的免疫保护作用，但对其他菌株的交叉免疫保护作用较弱或者没有。由于大肠杆菌血清型种类繁多，这种疫苗的开发远远满足不了免疫防控的要求。目前针对大肠杆菌的通用型疫苗研究较少。BamA蛋白属于Omp85蛋白家族，由810个氨基酸残基组成，前1～20个氨基酸为信号肽。N端位于周质空间，为周质多肽转运相关(periplasmicpolypeptidetransport-associated，POTRA)区域，C端为跨膜区，包含16条不连续的β-桶状跨膜链。作为外膜组装复合物的一部分，BamA主要参与外膜蛋白的正确组装。敲除BamA蛋白对大肠杆菌是致命的，因为会导致一系列的外膜蛋白，包括TolC，OmpF，OmpC及OmpA等蛋白无法正确的组装。减少BamA表达会引起对接触依赖性生长抑制剂的敏感性降低，及外膜蛋白合成的下调。该蛋白在大肠杆菌体内具有高度的保守性，具有开发成通用型疫苗的潜力。
技术实现思路
本专利技术旨在提供一种大肠杆菌重组外膜蛋白rBamA的制备方法，及其在免疫功能方面的应用。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为：一种大肠杆菌重组蛋白疫苗，重组蛋白疫苗为含有列表SEQIDNO.1的原核重组表达质粒pET-28a-rBamA。大肠杆菌重组蛋白疫苗的制备方法，所述质粒pET-28a-rBamA，以大肠杆菌CVCC1515为模板，采用BamAF-EcoRI/BamAR-NotI引物进行PCR扩增，PCR产物与载体pET-28a(+)连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，筛选转化子提取质粒，即为质粒pET-28a-rBamA。所述引物为BamAF-EcoRI：5’-GAATTCAATTGGTTAGGTACAGGTTATGC-3’，BamAR-NotI：5’-GCGGCCGCCCAGGTTTTGCCGATGTTGAACT-3’。大肠杆菌重组蛋白疫苗的应用，及所述重组蛋白疫苗在预防和治疗大肠杆菌病中的应用。附图说明图1为重组质粒pET-28a-rBamA构建及菌落PCR验证电泳图图2为重组外膜蛋白rBamA诱导SDS电泳图。图3为外膜蛋白纯化SDS电泳图。图4为小鼠免疫外膜蛋白血清效价。图5为外膜蛋白免疫小鼠攻毒大肠杆菌存活率。具体实施方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。在不背离本专利技术精神和实质的情况下，对本专利技术方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本专利技术的范围。若未特别指明，本专利技术实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。以下实施例中的定量试验，均设置三次或三次以上重复实验，结果取平均值。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(NewYork：GoldSpringHarborLaboratoryPress，1989)。实施例1.pET-28a-rBamA载体构建以大肠杆菌的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，扩增产物为1089bp，其引物序列如下：BamAF-EcoRI：5’-GAATTCAATTGGTTAGGTACAGGTTATGC-3’，BamAR-NotI：5’-GCGGCCGCCCAGGTTTTGCCGATGTTGAACT-3’。利用天根琼脂凝胶回收试剂盒(DP130419)对PCR产物切胶回收。将回收的PCR产物与pMD-19Tsimplevector连接，转化大肠杆菌DH5α，提取重组质粒测序。对测序正确的质粒及pET28a载体进行EcoRI和NotI双酶切。酶切体系如下：37℃水浴4h，1.5％琼脂糖凝胶电泳，切胶回收。将回收的OmpA，BamA，TolC双酶切片段分别与pET28a载体进行连接，连接体系如下：16℃连接2h.实施例2.目标蛋白的表达分别挑取对照菌和重组菌1～2个菌落，接入1mL含Kan(50μg/mL)的LB培养液，37℃振荡培养过夜。取50μL过夜培养物转接到5mL含Kan(50μg/mL)的LB培养液，37℃振荡培养至对数中期(OD600＝0.4～0.5)。向诱导管中加入IPTG使其终浓度达到1mmol/L，250rpm，37℃振荡培养8h左右取样，-20℃保存，以便SDS-PAGE电泳分析。诱导结束后，取1mL菌液，8000rmp，4℃离心收集菌体，2min，弃去上清，用200μLPBS重悬菌体，40μL6×SDS-PAGE上样缓冲液，100℃煮沸10min，室温12000rpm离心5min，取上清至新离心管中，进行SDS-PAGE电泳分析。经Geliance200凝胶电泳分析软件分析，IPTG诱导6h后，空菌株对照和空载体对照组无目的蛋白表达，重组菌株均有目的蛋白表达。BamA蛋白占细胞总蛋白比例在47.7％～60.95％之间。实施例3.菌体裂解及初步分离1)菌液于4℃，7000rpm离心20min，用8mL/g裂解缓冲液悬浮菌体后，冰上超声裂解菌体(5son，10soff)。2)4℃，14000g离心20min，去掉上清。3)每克包涵体溶于50mL50mMTris-HCl缓冲液(1.5％(v/v)LDAO，pH7.9)中，20℃震荡孵育1h。4)4℃，16000g离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗大肠杆菌感染的基因工程疫苗的制备方法，其特征在于首先提取大肠杆菌基因组，扩增其外膜蛋白BamA表面抗原区域基因，连接重组表达载体pET‑28a，转化大肠杆菌BL21。通过IPTG诱导大肠杆菌表达的包涵体利用8mol/L尿素和LDAO进行复性，并通过镍柱进行纯化获得重组外膜蛋白rBamA。

【技术特征摘要】
1.一种抗大肠杆菌感染的基因工程疫苗的制备方法，其特征在于首先提取大肠杆菌基因组，扩增其外膜蛋白BamA表面抗原区域基因，连接重组表达载体pET-28a，转化大肠杆菌BL21。通过IPTG诱导大肠杆菌表达的包涵体利用8mol/L尿素和LDAO进行复性，并通过镍柱进行纯化获得重组外膜蛋白rBamA。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于由外膜蛋白BamA的表面抗原区域由第448...

【专利技术属性】
技术研发人员：王建华，管庆丰，滕达，王秀敏，毛若雨，王潇，
申请(专利权)人：中国农业科学院饲料研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11