促进木瓜蛋白酶活性的方法技术

本发明专利技术涉及蛋白酶，具体涉及一种促进木瓜蛋白酶活性的方法。本发明专利技术所述的促进木瓜蛋白酶活性的方法，是将酶促进剂8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羟基–3–(4–羟基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮与木瓜蛋白酶一起添加到豌豆蛋白粉中，对豌豆蛋白粉进行酶解制备豌豆蛋白多肽粉。本发明专利技术的木瓜蛋白酶促进剂提高了木瓜蛋白酶的活性，缩短了酶解时间，提高了酶解效率；豌豆蛋白粉酶解后经冷冻干燥得到豌豆蛋白多肽粉，清除自由基效率更高；相比于未添加木瓜蛋白酶促进剂的豌豆蛋白多肽粉，羟基自由基清除率提高了5.3～18％，能够用于抗衰老、抗氧化的功能性食品的开发。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及蛋白酶，具体涉及一种促进木瓜蛋白酶活性的方法。
技术介绍
木瓜蛋白酶是一种热稳定性好、天然卫生安全的蛋白质水解酶，别名番木瓜酶或木瓜酶，分子量为23406，由一种单肽链组成，具有低特异性的特点，Cys25、His159和Asp158这三个氨基酸残基存在于木瓜蛋白酶的活性中心部位。可从番木瓜的根、茎、叶和果实内提取出木瓜蛋白酶。根据《GB2760-2011食品安全国家标准食品添加剂使用标准》的规定，木瓜蛋白酶可用作食品工业的加工助剂，即酶制剂。木瓜蛋白酶的提取方法有烘干法、单宁沉淀法、超滤法、絮凝法、盐析法、超声波法等，但大多数的提取方法存在降低酶活性，得到产品的纯度低，污染环境等诸多问题。虽然木瓜蛋白酶使用时具有pH范围广，热稳定性好等优点，但却受到提取工艺的限制。染料木素是自然界中最常见的一种黄酮类化合物，本身具有抗氧化、抗肿瘤作用、对血管的防护作用、提高免疫力和抗菌消炎等作用。8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羟基–3–(4–羟基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮是染料木素与1-(2,4-二甲基苯基)哌嗪经化学合成得到的一种染料木素衍生物，是对染料木素的改性。8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羟基–3–(4–羟基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮分子式为C28H28N2O5，分子量472.52，其结构式如下：目前，国内外未见8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羟基–3–(4–羟基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮在促进木瓜蛋白酶活性方面的应用报道。专利
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种采用8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羟基–3–(4–羟基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮作为酶促进剂，促进木瓜蛋白酶活性的方法，不仅缩短豌豆蛋白的酶解时间，提高酶解效率，而且得到的豌豆蛋白多肽粉，清除自由基效率更高。本专利技术所述的促进木瓜蛋白酶活性的方法，是将木瓜蛋白酶促进剂8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羟基–3–(4–羟基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮与木瓜蛋白酶一起添加到豌豆蛋白粉中，对豌豆蛋白粉进行酶解制备豌豆蛋白多肽粉。其中：木瓜蛋白酶促进剂的添加量为木瓜蛋白酶质量的2～4％，木瓜蛋白酶的添加量为豌豆蛋白粉质量的10～12％。酶解的pH为6.3～6.5，酶解温度为60～65℃，酶解时间为2～2.5h。酶解之后进行灭酶，灭酶温度为95～100℃，灭酶时间为5～10min。具体步骤如下：将豌豆蛋白粉溶解于磷酸缓冲溶液中，加入木瓜蛋白酶和木瓜蛋白酶促进剂，经酶解、灭酶、冷却过滤后得到豌豆多肽液，豌豆多肽液再经冷冻干燥得到豌豆蛋白多肽粉。将豌豆蛋白多肽粉以15～17.2mg/mL的浓度添加到普通饮料中，制成抗氧化、抗衰老的功能性饮料。木瓜蛋白酶促进剂8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羟基–3–(4–羟基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮，为染料木素与1-(2,4-二甲基苯基)哌嗪的化学合成物，具体制备过程如下：在50mL圆底烧瓶中加入染料木素1mmol，无水乙醇25mL和37％甲醛水溶液0.08mL，加热至55～60℃，反应液澄清后，加入1-(2,4-二甲基苯基)哌嗪0.19mL，室温搅拌48h，有固体析出，过滤，固体经重结晶分离纯化，得到本专利技术的酶促进剂。本专利技术中木瓜蛋白酶促进剂与木瓜蛋白酶的一个精氨酸残基以一个氢键相互结合，并以四个π键分别与另外两个精氨酸残基结合，这种结合导致了木瓜蛋白酶构象的改变，从而提高了木瓜蛋白酶的活性。与现有技术相比，本专利技术的有益效果如下：(1)本专利技术的木瓜蛋白酶促进剂提高了木瓜蛋白酶的活性，其与木瓜蛋白酶一起添加到豌豆蛋白粉中，具有协同作用，缩短了酶解时间，提高了酶解效率。(2)豌豆蛋白粉酶解后经冷冻干燥得到豌豆蛋白多肽粉，清除自由基效率更高；相比于未添加木瓜蛋白酶促进剂的豌豆蛋白多肽粉，羟基自由基清除率提高了5.3～18％，能够用于抗衰老、抗氧化的功能性食品的开发。具体实施方式以下结合实施例对本专利技术做进一步描述。实施例1将豌豆蛋白粉溶解于pH值为6.5的磷酸缓冲溶液中，形成豌豆蛋白粉质量浓度为7％的分散液，加入占豌豆蛋白粉质量12％的木瓜蛋白酶，同时加入占木瓜蛋白酶质量2％的木瓜蛋白酶促进剂8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羟基–3–(4–羟基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮，在pH值为6.5，温度为65℃条件下水浴震荡酶解2h，酶解结束后，酶解液在100℃维持5min灭酶，然后冷却至室温，过滤得到豌豆多肽液。用甲醛滴定法测量水解度，发现加木瓜蛋白酶促进剂后，豌豆蛋白的酶解度提高33％，酶解时间缩短了25％。将豌豆多肽液经真空冷冻干燥得豌豆多肽粉。将豌豆多肽粉以16mg/mL的浓度添加到普通饮料中，得到具有抗氧化、抗衰老作用的功能性饮料，其羟基自由基清除率达65％，与未使用木瓜蛋白酶促进剂相比，清除率提高了18％。实施例2将豌豆蛋白粉溶解于pH值为6.3的磷酸缓冲溶液中，形成豌豆蛋白粉质量浓度为7％的分散液，加入占豌豆蛋白粉质量10％的木瓜蛋白酶，同时加入占木瓜蛋白酶质量4％的木瓜蛋白酶促进剂8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羟基–3–(4–羟基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮，在pH值为6.3，温度为60℃条件下水浴震荡酶解2.5h，酶解结束后，酶解液在95℃维持10min灭酶，然后冷却至室温，过滤得到豌豆多肽液。用甲醛滴定法测量水解度，发现加木瓜蛋白酶促进剂后，豌豆蛋白的酶解度提高16％，酶解时间缩短了7％。将豌豆多肽液经真空冷冻干燥得豌豆多肽粉。将豌豆多肽粉以15mg/mL的浓度添加到普通饮料中，得到具有抗氧化、抗衰老作用的功能性饮料，其羟基自由基清除率达58％，与未使用木瓜蛋白酶促进剂相比，清除率提高了5.3％。实施例3将豌豆蛋白粉溶解于pH值为6.4的磷酸缓冲溶液中，形成豌豆蛋白粉质量浓度为7％的分散液，加入占豌豆蛋白粉质量11％的木瓜蛋白酶，同时加入占木瓜蛋白酶质量3％的木瓜蛋白酶促进剂8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羟基–3–(4–羟基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮，在pH值为6.4，温度为63℃条件下水浴震荡酶解2.3h，酶解结束后，酶解液在95℃维持10min灭酶，然后冷却至室温，过滤得到豌豆多肽液。用甲醛滴定法测量水解度，发现加木瓜蛋白酶促进剂后，豌豆蛋白的酶解度提高25％，酶解时间缩短了15％。将豌豆多肽液经真空冷冻干燥得豌豆多肽粉。将豌豆多肽粉以17.2mg/mL的浓度添加到普通饮料中，得到具有抗氧化、抗衰老作用的功能性饮料，其羟基自由基清除率达61％，与未使用木瓜蛋白酶促进剂相比，清除率提高了11％。本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种促进木瓜蛋白酶活性的方法，其特征在于：将木瓜蛋白酶促进剂8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羟基–3–(4–羟基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮与木瓜蛋白酶一起添加到豌豆蛋白粉中，对豌豆蛋白粉进行酶解制备豌豆蛋白多肽粉。

【技术特征摘要】
1.一种促进木瓜蛋白酶活性的方法，其特征在于：将木瓜蛋白酶促进剂8–((4–(2,4–二甲氧基苯基)哌嗪–1–基)甲基)–5,7–二羟基–3–(4–羟基苯基)–4H–苯并吡喃–4–酮与木瓜蛋白酶一起添加到豌豆蛋白粉中，对豌豆蛋白粉进行酶解制备豌豆蛋白多肽粉。2.根据权利要求1所述的促进木瓜蛋白酶活性的方法，其特征在于：木瓜蛋白酶促进剂的添加量为木瓜蛋白酶质量的2～4％，木瓜蛋白酶的添加量为豌豆蛋白粉质量的10～12％。3.根据权利要求1所述的促进木瓜蛋白酶活性的方法，其特征在于：酶解pH值为6.3～6.5，酶解温度为60～65...

【专利技术属性】
技术研发人员：周泉城，冯传兴，王琪，王赛，孙婉婷，孙阳，解志轲，高知阳，
申请(专利权)人：山东理工大学，
类型：发明
国别省市：山东;37