一种基于磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法技术

本发明专利技术公开了一种基于磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，将DOTA共价连接到经过氨基修饰的磁性纳米材料NH2‑MNP表面；随后金属离子Zn2+通过与DOTA的螯合作用固定在材料表面形成Fe3O4@DOTA‑Zn纳米颗粒；将所得到的Fe3O4@DOTA‑Zn颗粒悬浮于含硝酸锌和2‑咪唑甲醛的DMF溶液中；再采用制备的磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA‑ZIF‑90进行标准磷酸化蛋白和Hela细胞全蛋白提取物复杂样本中的磷酸肽富集。该合成的磁性MOF材料金属固载量大、金属复合物稳定、亲水性好；合成的不同金属离子固载的磁性MOF材料在全磷酸肽富集过程中选择性高、灵敏度高、富集效率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及分析化学领域，具体是一种基于新型磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法。
技术介绍
蛋白质磷酸化修饰作为一种重要的蛋白质翻译后修饰方式，广泛参与调控细胞内诸多生命活动。虽然磷酸化蛋白质组学已经取得了很大的进展，但由于磷酸肽丰度低、不易离子化且在质谱鉴定中存在大量非特异性肽段的干扰，使得磷酸肽的直接鉴定存在很多困难。因此，研究快速高效、特异性强的磷酸肽富集分离方法仍然有着十分重要的意义。目前，应用较为广泛的磷酸肽富集分离方法主要有金属氧化物亲和色谱法(MetalOxideAffinityChromatography，MOAC)和固相金属离子亲和色谱法(Immobilizedmetalionaffinitychromatography，IMAC)。其中，金属氧化物亲和色谱法中基于TiO2的富集分离方法由于具有较高的特异性和灵敏度而应用最为频繁。但研究证明TiO2更易分离出单磷酸化肽段，由于TiO2对多磷酸化位点肽段具有较强的吸附性而不易将其洗脱。该方法对于鉴定多磷酸肽仍然存在一定困难。因此，基于IMAC的磷酸肽富集分离策略由于对单位点磷酸化肽段和多位点磷酸化肽段的富集不存在偏性而受到了越来越多的关注。IMAC富集磷酸肽的基本原理是Zr4+，Fe3+，Ti4+等金属阳离子与适当的配体（如磷酸基团、氨三乙酸、亚氨乙酸）进行螯合形成金属复合物从而将金属离子固定在材料表面。在酸性环境下，磷酸肽特有的磷酸基团通过与金属离子的螯合作用吸附在材料上，从而与样品中的非磷酸化肽段进行了分离。在碱性环境下，这种特异性吸附作用被破坏，磷酸肽被洗脱下来进而进行鉴定。然而研究表明，基于传统IMAC方法富集磷酸肽的特异性不高。一方面，单一金属离子的应用使材料在富集磷酸肽的同时也吸附了一些非特异性肽段，导致磷酸肽在质谱检测中信号受到抑制而影响检测效果；另一方面，用于固载金属的配体的亲疏水性也直接影响磷酸肽的富集效果。金属有机骨架（metal-organicframeworks，MOF）材料是一类由金属离子和有机配位体通过自组装形成的材料。由于其具有较大的比表面积和孔隙率、结构和功能的可变性，已广泛应用于氢气储存、催化、生物传感器、气体分离等领域。为了使MOFs材料有更广泛的应用，目前有两种方法对MOFs材料进行功能基团修饰，即合成前功能化和合成后修饰。合成前功能化策略是指在MOFs材料合成前选择具有功能基团的配体，合成后的MOFs材料带有此目标基团，IRMOFs（IsoreticularMetal–OrganicFramework）和ZIF（ZeoliticImidazolateFrameworks）系列材料都是利用该方法合成的。合成后修饰方法是指通过与MOFs材料的固有基团的共价连接或与不饱和金属离子的配位作用而引入新的功能基团，该方法已被证明是MOFs材料进行合成后修饰和应用的一种高效而实用的方法。最近，在蛋白质组学领域研究中，MOFs材料已合成并应用于大分子蛋白的筛除、低丰度肽段富集、磷酸肽/糖肽富集等。Gu等人合成了MIL-53，MIL-100，MIL-101用于肽段富集，由于MOFs材料中的孔径结构，使得在富集肽段的同时，又可以去除分子量较大的蛋白质，实现了蛋白和肽段的分离，然而这几种MOFs材料需要借助离心的手段进行分离，使得操作过程不便而且容易引起材料的丢失；Zhao等合成了Fe3O4@PDA@[Cu3(btc)2]用于不同蛋白酶的固定和蛋白质的酶解，然而由于蛋白酶是通过非特异性吸附作用固定在材料上的，导致在蛋白质酶切的过程中酶会随着温度等变化而从材料上脱落，这极大限制了该类固定化酶反应器的应用。因此，考虑到蛋白酶固定在MOFs材料上的不同方式以及磁性材料易于操作的优势，设计和和合成新型的磁性MOFs材料用于蛋白酶的共价固定仍然是十分必要的。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种基于新型磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，以解决上述
技术介绍
中提出的问题。为实现上述目的，本专利技术提供如下技术方案：一种基于新型磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，包括：（1）磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90的制备首先，将DOTA共价连接到经过氨基修饰的磁性纳米材料NH2-MNP表面；随后金属离子Zn2+通过与DOTA的螯合作用固定在材料表面形成Fe3O4@DOTA-Zn纳米颗粒；然后，将所得到的Fe3O4@DOTA-Zn颗粒悬浮于含硝酸锌和2-咪唑甲醛的DMF溶液中；（2）磷酸肽富集采用步骤（1）制备的磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90进行标准磷酸化蛋白和Hela细胞全蛋白提取物复杂样本中的磷酸肽富集。作为本专利技术进一步的方案：步骤（1）的具体操作步骤为：一、将1mLNH2-MNP置于含有10mgDOTA的乙腈溶液中，反应4h，然后用水和乙醇分别洗涤三次；将磁性纳米颗粒重悬在含有8mMZn(NO3)2·4H2O的乙醇溶液中，70℃条件下反应6h，得到Fe3O4@DOTA-Zn2+颗粒；将得到的Fe3O4@DOTA-Zn2+颗粒用乙醇和去离子水分别洗涤三次，并在4℃条件下储存备用；二、将硝酸锌和2-咪唑甲醛按2：3的摩尔比溶解于DMF溶液，然后从步骤一得到的Fe3O4@DOTA-Zn2+颗粒中取1mL加入到含硝酸锌和2-咪唑甲醛的DMF溶液中，将混合物溶液在100℃条件下加热18h，起始外层ZIF-90的生长，得到磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90；三、通过外加磁场对上述磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90进行分离和收集，并分别用DMF和二氯甲烷进行洗涤，最后将所得磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90在80℃烘箱中烘干备用。作为本专利技术再进一步的方案：步骤（2）的具体步骤为：取磁性MOF材料置于1.5mL离心管中，用上样缓冲液（50%乙腈，1%TFA）清洗三次；向离心管中加入150μL上样缓冲液重悬磁性MOF材料，加入蛋白酶切产物，室温涡旋15min；在外加磁场作用下，吸去上清液，用上样缓冲液和洗涤缓冲液（50%乙腈，0.1%TFA）各漂洗材料三次；用1μL0.1M氨水洗脱结合在材料上的磷酸肽，重复五次。作为本专利技术再进一步的方案：所述NH2-MNP通过热溶剂法制备。与现有技术相比，本专利技术的有益效果是：该合成的磁性MOF材料具有较大的金属固载量、稳定的金属复合物以及良好的亲水性；实验结果表明，合成的不同金属离子固载的磁性MOF材料在全磷酸肽富集过程中具有更高的选择性、灵敏度及富集效率；与传统的TiO2方法相比，由于材料具有良好的磁响应能力使得操作过程更加省时、便捷。附图说明图1为固载Ti的磁性MOF材料富集磷酸肽后的质谱图。图2为固载Zr的磁性MOF材料富集磷酸肽后的质谱图。图3为固载Fe的磁性MOF材料富集磷酸肽后的质谱图。图4为固载Tb的磁性MOF材料富集磷酸肽后的质谱图。图5为固载Tm的磁性MOF材料富集磷酸肽后的质谱图。图6为固载Ho的磁性MOF材料富集磷酸肽后的质谱图。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利的技术方案作进一步详细地说明。请参阅图1-6，一种基于新型磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，包括：（1）磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于新型磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，其特征在于，包括：（1）磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA‑ZIF‑90的制备首先，将DOTA共价连接到经过氨基修饰的磁性纳米材料NH2‑MNP表面；随后金属离子Zn2+通过与DOTA的螯合作用固定在材料表面形成Fe3O4@DOTA‑Zn纳米颗粒；然后，将所得到的Fe3O4@DOTA‑Zn颗粒悬浮于含硝酸锌和2‑咪唑甲醛的DMF溶液中；（2）磷酸肽富集采用步骤（1）制备的磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA‑ZIF‑90进行标准磷酸化蛋白和Hela细胞全蛋白提取物复杂样本中的磷酸肽富集。

【技术特征摘要】
1.一种基于新型磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，其特征在于，包括：（1）磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90的制备首先，将DOTA共价连接到经过氨基修饰的磁性纳米材料NH2-MNP表面；随后金属离子Zn2+通过与DOTA的螯合作用固定在材料表面形成Fe3O4@DOTA-Zn纳米颗粒；然后，将所得到的Fe3O4@DOTA-Zn颗粒悬浮于含硝酸锌和2-咪唑甲醛的DMF溶液中；（2）磷酸肽富集采用步骤（1）制备的磁性MOFs材料Fe3O4@DOTA-ZIF-90进行标准磷酸化蛋白和Hela细胞全蛋白提取物复杂样本中的磷酸肽富集。2.根据权利要求1所述的基于新型磁性多孔材料的磷酸肽富集新方法，其特征在于，步骤（1）的具体操作步骤为：一、将1mLNH2-MNP置于含有10mgDOTA的乙腈溶液中，反应4h，然后用水和乙醇分别洗涤三次；将磁性纳米颗粒重悬在含有8mMZn(NO3)2·4H2O的乙醇溶液中，70℃条件下反应6h，得到Fe3O4@DOTA-Zn2+颗粒；将得到的Fe3O4@DOTA-Zn2+颗粒用乙醇和去离子水分别洗涤三次，并在4℃条件下储存备用；二、将硝酸锌和2-咪唑甲醛按2：3...

【专利技术属性】
技术研发人员：钱小红，秦伟捷，张万军，
申请(专利权)人：北京蛋白质组研究中心，
类型：发明
国别省市：北京;11