一种非人灵长类动物血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系制造技术

本发明专利技术涉及一种非人灵长类动物血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系。提供了一种新型的非人灵长类动物血管内皮祖细胞高效扩增培养方法，该方法可以高效地获得具有内皮活性功能的内皮祖细胞/内皮细胞，从而满足在灵长类动物自体回输移植的临床前研究中所需要的细胞数量，为内皮祖细胞扩增培养技术应用于临床上治疗提供了有效途径。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于细胞生物学领域，更具体地，本专利技术涉及一种非人灵长类动物血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系。
技术介绍
细胞治疗是近年来兴起的疾病治疗新技术，是利用某些具有特定功能的细胞特性，通过体外扩增、特殊培养等处理后，达到治疗疾病的目的。内皮祖细胞(Endothelialprogenitorcells，EPCs)是血管内皮细胞的前体细胞，主要存在于脐带血、成人外周血、骨髓。近年来的研究显示，内皮祖细胞在心脑血管疾病、外周血管疾病、肿瘤血管形成及创伤愈合等方面均发挥重要作用，同时，因其在扩增和分化过程中表达FVIII以及游走的移植特性，可作为一种细胞治疗途径用于FVIII缺乏的甲型血友病，已有报道称可通过同源移植正常的内皮祖细胞缓解hemophiliaA小鼠的出血症状，提高存活率。正常情况下，内皮祖细胞在血液循环系统中的数量极少，只占外周血中的0.005-0.01％，脐带血中也只有0.2-1％，直接获取的数量无法满足临床治疗以及科研的需要。近年来的研究表明可通过基因干预或添加特定细胞因子、小分子化合物及化学成分的方式在一定程度上促进其扩增效率。目前，血管内皮祖细胞的体外培养主要是通过密度梯度离心法分离脐血、外周血、骨髓中的单个核细胞，进一步采用CD34、CD133免疫磁珠阳性筛选后在内皮生长因子(VEGF、EGF、IGF等)诱导下进行扩增与分化。此前，本专利技术人通过新建的培养技术(一种人血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系201410397090.2)已经实现人脐血及动员后外周血中血管内皮祖细胞的体外高效、安全的扩增。但是，本领域当前尚无针对非人灵长类动物来源血管内皮祖细胞的扩增手段，为了更好地在非人灵长类动物水平上进行临床前体内功能性研究，一种优化的非人灵长类动物血管内皮祖细胞培养技术亟待建立。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种非人灵长类动物血管内皮祖细胞的高效扩增培养体系。在本专利技术的第一方面，提供一种培养非人灵长类动物血管内皮祖细胞的方法(为非治疗性方法)，所述方法包括：(1)利用干细胞扩增培养基扩增非人灵长类动物CD34+单个核细胞；(2)将步骤(1)扩增后的细胞转移到内皮祖细胞培养基中培养，获得非人灵长类动物血管内皮祖细胞；其中，所述的干细胞扩增培养基包括：干细胞基础培养基以及如下细胞因子：干细胞因子(SCF)：50-500ng/mL；Flt3-配体(FLT-3L)：50-500ng/mL；血小板因子(TPO)：5-200ng/mL；白介素3(IL-3)：5-50ng/mL；粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)：5-25ng/mL；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)：5-25ng/mLSall样蛋白4B(Sall4B)：1-10ng/mL；和血管内皮生长因子(VEGF)：15-150ng/mL。其中，所述的内皮祖细胞培养基包括：内皮细胞基础培养基以及如下组分：血管内皮生长因子(VEGF)：5-100ng/mL；胰岛素样生长因子(IGF)：5-100ng/mL；表皮细胞生长因子(EGF)：2-20ng/mL；成纤维细胞生长因子(b-FGF)：5-100ng/mL；抗坏血酸(AscorbicAcid)：0.5-6μg/mL；肝素(Heparin)：40-200U/mL；氢化可的松(Hydrocortisone)：80-300ng/mL；和L谷胺酰胺(L-glutamine)：1-6mM。在一个优选例中，所述的干细胞基础培养基选自(但不限于)：ModifiedIMDM培养基或ModifiedStemSpan培养基；或所述的内皮细胞基础培养基选自(但不限于)：EBM-2培养基、M199、M200培养基等类似培养基(较佳地含有5-25％胎牛血清)。在另一优选例中，步骤(1)包括：CD34+单个核细胞加入到所述的干细胞扩增培养基中，使得细胞浓度为3-20×105个细胞/mL(较佳地为6-12×105个细胞/mL)；培养2-4天后根据细胞数目增加量进行分孔并添加所述的干细胞扩增培养基使得细胞浓度为3-20×105个细胞/mL(较佳地为6-12×105个细胞/mL)；步骤(1)进行5-7天。在另一优选例中，步骤(2)包括：步骤(1)进行5-7天后，将获得的细胞转移到所述的内皮祖细胞培养基中、置于包被有纤维连接蛋白的培养板中培养，细胞在培养基中密度为0.3-3×106个细胞/mL(较佳地0.5-2×106个细胞/mL)，继续培养2-4天后吹散细胞，选择贴壁细胞继续培养；后续每2-3天更换1次内皮祖细胞培养基；更换3-6次后收获细胞。在另一优选例中，所述的非人灵长类动物包括：猴。在本专利技术的另一方面，提供一种以扩增CD34+单个核细胞为主的干细胞扩增培养基，其中包括：干细胞基础培养基以及如下细胞因子：干细胞因子(SCF)：50-500ng/mL；Flt3-配体(FLT-3L)：50-500ng/mL；血小板因子(TPO)：5-200ng/mL；白介素3(IL-3)：5-50ng/mL；粒细胞集落刺激生物因子(GM-CSF)：5-25ng/mL；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)：5-25ng/mLSall样蛋白4B(Sall4B)：1-10ng/mL；和血管内皮生长因子(VEGF)：15-150ng/mL。在一个优选例中，所述的用于扩增CD34+单个核细胞的干细胞扩增培养基中包括如下细胞因子：干细胞因子：100-400ng/mL；Flt3-配体：100-400ng/mL；血小板因子：10-150ng/mL；白介素3：5-30ng/mL；粒细胞集落刺激生物因子：8-20ng/mL；粒细胞集落刺激因子：8-20ng/mLSall样蛋白4B：2-8ng/mL；和血管内皮生长因子(VEGF)：20-100ng/mL。在本专利技术的另一方面，提供一种用于培养非人灵长类动物血管内皮祖细胞的培养基，其中包括：内皮细胞基础培养基以及如下组分：血管内皮生长因子(VEGF)：5-100ng/mL；胰岛素样生长因子(IGF)：5-100ng/mL；表皮细胞生长因子(EGF)：2-20ng/mL；成纤维细胞生长因子(b-FGF)：5-100ng/mL；抗坏血酸(AscorbicAcid)：0.5-6μg/mL；肝素(Heparin)：40-200U/mL；氢化可的松(Hydrocortisone)：80-300ng/mL；和L谷胺酰胺(L-glutamine)：1-6mM。在一个优选例中，所述的用于培养非人灵长类动物血管内皮祖细胞的培养基中，所述组分包括：血管内皮生长因子：10-80ng/mL；胰岛素样生长因子：10-80ng/mL；表皮细胞生长因子：4-16ng/mL；成纤维细胞生长因子：8-80ng/mL；抗坏血酸：1-4μg/mL；肝素：80-200U/mL；氢化可的松：100-250ng/mL；和L谷胺酰胺：2-5mM。在本专利技术的另一方面，提供前面任一所述的培养基的用途，用于制备非人灵长类动物血管内皮祖细胞。在本专利技术的另一方面，提供一种用于制备非人灵长类动物血管内皮祖细胞的试剂盒，所述试剂盒中包括：(a)所述的以扩本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种培养非人灵长类动物血管内皮祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)利用干细胞扩增培养基扩增非人灵长类动物CD34+单个核细胞；(2)将步骤(1)扩增后的细胞转移到内皮祖细胞培养基中培养，获得非人灵长类动物血管内皮祖细胞；其中，所述的干细胞扩增培养基包括：干细胞基础培养基以及如下细胞因子：干细胞因子：50‑500ng/mL；Flt3‑配体：50‑500ng/mL；血小板因子：5‑200ng/mL；白介素3：5‑50ng/mL；粒细胞集落刺激生物因子：5‑25ng/mL；粒细胞集落刺激因子：5‑25ng/mLSall样蛋白4B：1‑10ng/mL；和血管内皮生长因子：15‑150ng/mL。其中，所述的内皮祖细胞培养基包括：内皮细胞基础培养基以及如下组分：血管内皮生长因子：5‑100ng/mL；胰岛素样生长因子：5‑100ng/mL；表皮细胞生长因子：2‑20ng/mL；成纤维细胞生长因子：5‑100ng/mL；抗坏血酸：0.5‑6μg/mL；肝素：40‑200U/mL；氢化可的松：80‑300ng/mL；和L谷胺酰胺：1‑6mM。

【技术特征摘要】
1.一种培养非人灵长类动物血管内皮祖细胞的方法，其特征在于，所述方法包括：(1)利用干细胞扩增培养基扩增非人灵长类动物CD34+单个核细胞；(2)将步骤(1)扩增后的细胞转移到内皮祖细胞培养基中培养，获得非人灵长类动物血管内皮祖细胞；其中，所述的干细胞扩增培养基包括：干细胞基础培养基以及如下细胞因子：干细胞因子：50-500ng/mL；Flt3-配体：50-500ng/mL；血小板因子：5-200ng/mL；白介素3：5-50ng/mL；粒细胞集落刺激生物因子：5-25ng/mL；粒细胞集落刺激因子：5-25ng/mLSall样蛋白4B：1-10ng/mL；和血管内皮生长因子：15-150ng/mL。其中，所述的内皮祖细胞培养基包括：内皮细胞基础培养基以及如下组分：血管内皮生长因子：5-100ng/mL；胰岛素样生长因子：5-100ng/mL；表皮细胞生长因子：2-20ng/mL；成纤维细胞生长因子：5-100ng/mL；抗坏血酸：0.5-6μg/mL；肝素：40-200U/mL；氢化可的松：80-300ng/mL；和L谷胺酰胺：1-6mM。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的干细胞基础培养基选自：ModifiedIMDM培养基或ModifiedStemSpan培养基；或所述的内皮细胞基础培养基选自：EBM-2培养基、M199、M200培养基等类似培养基。3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)包括：CD34+单个核细胞加入到所述的干细胞扩增培养基中，使得细胞浓度为3-20×105个细胞/mL；培养2-4天后根据细胞数目增加量进行分孔并添加所述的干细胞扩增培养基使得细胞浓度为3-20×105个细胞/mL；步骤(1)进行5-7天。4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)包括：步骤(1)进行5-7天后，将获得的细胞转移到所述的内皮祖细胞培养基中、置于包被有纤维连接蛋白的培养板中培养，细胞在培养基中密度为0.3-3×106个细胞/mL，继续培养2-4天后吹散...

【专利技术属性】
技术研发人员：蒋永平，秦蒙，
申请(专利权)人：苏州方舟基因药业有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32