一种I群4型禽腺病毒、灭活疫苗及其制备方法技术

本发明专利技术提供一种I群4型禽腺病毒、灭活疫苗及其制备方法，涉及生物工程领域。I群4型禽腺病毒SD2015株，保藏号为：CCTCC NO：V201645。本发明专利技术还提供一种I群4型禽腺病毒灭活疫苗，含有灭活的所述I群4型禽腺病毒SD2015株。制备I群4型禽腺病毒SD2015株病毒液的方法，采用SPF鸡胚增殖所述I群4型禽腺病毒SD2015株，得到I群4型禽腺病毒SD2015株毒液。本发明专利技术I群4型禽腺病毒SD2015株在鸡胚上培养，毒价高，达到105.80EID50/0.2ml以上，免疫原性好，对鸡和环境均安全。本发明专利技术I群4型禽腺病毒灭活疫苗，免疫后抗体水平高、持续时间长，保护率高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物工程领域，具体涉及一种I群4型禽腺病毒、灭活疫苗及其制备方法。
技术介绍
由禽腺病毒I群4型引起的心包积液肝炎综合症(HHS)是侵害鸡的一种急性传染病，以高发病率和高死亡率、心包腔中有淡黄色积液，肝脏肿大质脆，多发性局灶性坏死，肾脏肿大为特征。该病于1987年3月在巴基斯坦发生，随后在墨西哥、印度、秘鲁等很多国家均有发生，我国对该病的相关报道较少。这一疾病自从被发现以来，给养禽业造成重大的经济损失。大多数报道心包积液肝炎综合症是一种主要危害肉鸡的疾病，主要侵害3～5周龄的肉鸡和未成年的种用后备肉鸡，但在最近几年中，其在商品蛋鸡的高死亡率方面也起着重要作用。早在2010年我国就有零星发生，但没有形成大的流行趋势，在2015年初夏时开始发病急剧上升，首先从山东地区开始，后各地陆续报导增多。现有技术中，还未有商品化的I群4型禽腺病毒灭活疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供I群4型禽腺病毒SD2015株，保藏号为：CCTCCNO：V201645，该毒株在SPF鸡胚中增殖，病毒含量大于等于105.80EID50/0.2ml，且具有优良的免疫原性。本专利技术的另一目的是提供I群4型禽腺病毒SD2015株病毒液的制备方法，该方法简单、安全、高效，抗原增殖滴度较高。本专利技术的再一目的是提供一种I群4型禽腺病毒灭活疫苗，含有灭活的I群4型禽腺病毒SD2015株，该毒株在SPF鸡胚中增殖，病毒含量大于等于105.80EID50/0.2ml，上述I群4型禽腺病毒灭活疫苗免疫后抗体水平高、持续时间长，对肉鸡、蛋鸡及其子代保护率高，能较好地控制禽心包积液肝炎综合征疾病的发生与流行。本专利技术还提供所述I群4型禽腺病毒灭活疫苗的制备方法，该方法简单，安全，成本低。本专利技术的目的采用如下技术方案实现。本专利技术提供一种I群4型禽腺病毒SD2015株，保藏号为：CCTCCNO：V201645。本专利技术还提供一种I群4型禽腺病毒灭活疫苗，含有灭活的所述I群4型禽腺病毒SD2015株。优选的技术方案中，所述灭活疫苗为油乳剂灭活疫苗。本专利技术还提供制备I群4型禽腺病毒SD2015株病毒液的方法，采用SPF鸡胚增殖所述I群4型禽腺病毒SD2015株，得到I群4型禽腺病毒SD2015株毒液。优选的技术方案中，将所述I群4型禽腺病毒SD2015株接种SPF鸡胚，收获病变鸡胚的尿囊液、绒毛尿囊膜和胚体，匀浆，冻融，离心取上清液，得到I群4型禽腺病毒SD2015株病毒液。本专利技术还提供一种所述I群4型禽腺病毒灭活疫苗的制备方法，包括：(1)采用甲醛灭活I群4型禽腺病毒SD2015株；(2)将注射用白油和司本-80按照体积比94：6混合混匀，作为油相溶液；(3)将灭活的I群4型禽腺病毒SD2015株毒液和吐温-80按照体积比96：4混合均匀，作为水相溶液；(4)乳化：将油相溶液和水相溶液按照体积比2～3:1混和均匀、乳化，即获得所述I群4型禽腺病毒灭活疫苗。优选的技术方案中，灭活后的I群4型禽腺病毒SD2015株病毒液中甲醛的体积百分浓度为0.15％～0.25％。优选的技术方案中，0.2mlI群4型禽腺病毒SD2015株病毒液的病毒含量≥105.80EID50。有益效果：本专利技术I群4型禽腺病毒SD2015株在鸡胚上培养，毒价高，达到105.80EID50/0.2ml以上，免疫原性好，对鸡和环境均安全。本专利技术I群4型禽腺病毒灭活疫苗，免疫后抗体水平高、持续时间长，保护率高，能较好地控制禽心包积液肝炎综合征疾病的发生与流行，显著提高养禽生产的经济效益。附图说明图1是Hexon基因扩增产物的电泳图。具体实施方式实施例1I群4型禽腺病毒SD2015株的筛选与鉴定1.病毒的分离取山东地区发病鸡群临床症状出现心包积液，肝脏肿大质脆或坏死，肾脏肿大的病鸡的肝脏组织，与灭菌PBS缓冲液以1∶2混合后研磨，按2000IU/ml加入青霉素、链霉素，4℃作用1小时后，反复冻融3次，8000r/min离心15分钟，8层纱布过滤后，取滤液用0.22μm滤器过滤后经卵黄囊接种6日龄SPF鸡胚15枚，每胚0.2ml，封口后置于37.0℃孵育10天，弃去接种后48h内死胚，取接种后48h～240h死亡鸡胚，死亡鸡胚表现为胚体出血、蜷曲、肝脏肿大质脆、出血或坏死，有的死胚出现心包积液。取死亡鸡胚的尿囊液、尿囊膜及胚体(去眼睛、喙及腿)，匀浆，按2000IU/ml加入青霉素、链霉素，4℃作用1小时后，置灭菌的容器中冻融3次，8000r/min离心15分钟，取上清液采用8层纱布过滤，取滤液-20℃保存，以备进行鉴定并作进一步纯化。2.动物回归试验将本实施例标题1最终得到的上清液接种10只28日龄SPF鸡，每只颈部皮下注射0.2ml，连续观察7天，记录结果。结果攻毒后3天10/10发病，至第5天10/10死亡，临床症状表现为精神萎顿，食欲下降，羽毛松乱、排黄绿色稀粪，严重者卧地不起直至死亡。剖检发现，死亡鸡心包充满淡黄色积液；肝脏肿大、质脆，有的边缘有坏死斑点；肾脏肿大。取死亡鸡肝脏制备组织切片观察病理组织学病变，肝细胞多灶性凝固性坏死，伴有单核细胞浸润和嗜碱性核内包涵体。取病变肝脏匀浆后进行电镜检查，可发现鸡肝细胞中有大量典型的六角形腺病毒粒子。3.病毒的鉴定3.1PCR检测及基因测序提取上述分离的病毒液(即本实施例标题1最终得到的上清液)中的DNA，具体步骤如下：取病毒液400μl，加入12.5μl蛋白酶K溶液和50μl浓度为10％的SDS溶液，混匀，56℃作用30min；依次加入200μl氯仿和200μl苯酚，剧烈震荡15s，室温放置5min；4℃、12000rpm，离心10min；取上清，加入等体积的氯仿混匀，室温放置5min；4℃、12000rpm，离心10min；取上清，加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积、浓度为3M的乙酸钠溶液，-20℃放置30min；4℃、12000rpm，离心10min；弃上清，加入75％的乙醇溶液1000μl洗涤；4℃、12000rpm，离心5min；弃上清，干燥10min；加入30μl双蒸水溶解沉淀并作为模板进行PCR扩增。设计一对I群禽腺病毒Hexon基因区域引物进行PCR鉴定。Hexon上游引物为5’-GTCTATACCAACACGAGCACC-3’，Hexon下游引物为5’-GGTTAATGAAGTTATCCCTGAACCC。PCR扩增的反应体系(20μl)：模板3μl，2×PremixTaq(购自上海生工生物工程有限公司)10μl，Hexon上下游引物各1μl，双蒸水5μl。PCR反应程序：94℃预变性5min；进入循环：94℃30s，52℃30s，72℃1min，35个循环；72℃延伸10min。PCR扩增产物用1％琼脂糖凝胶电泳进行检测。电泳结果(图1)显示分离毒株扩出了相应的目的片段，与预期的目的片段大小相符。将扩增出的目的片段送上海英骏生物技术有限公司进行测序，结果显示片段大小为686bp，序列如SEQIDNO:1所示。采用DNAStar软件对测得的Hexon基因的核苷酸序列(SEQIDNO:1)进行分析，并分别与GenBank中I群禽腺病毒毒株的相应序列进行比较，发现所分离的病毒与I群4型禽腺病毒同源性本文档来自技高网...

【技术保护点】
I群4型禽腺病毒SD2015株，保藏号为： CCTCC NO：V201645。

【技术特征摘要】
1.I群4型禽腺病毒SD2015株，保藏号为：CCTCCNO：V201645。2.一种I群4型禽腺病毒灭活疫苗，其特征在于：该I群4型禽腺病毒灭活疫苗含有灭活的权利要求1所述I群4型禽腺病毒SD2015株。3.根据权利要求2所述I群4型禽腺病毒灭活疫苗，其特征在于所述灭活疫苗为油乳剂灭活疫苗。4.制备I群4型禽腺病毒SD2015株病毒液的方法，其特征在于采用SPF鸡胚增殖权利要求1所述I群4型禽腺病毒SD2015株，得到I群4型禽腺病毒SD2015株病毒液。5.根据权利要求4所述制备I群4型禽腺病毒SD2015株病毒液的方法，其特征在于权利要求1所述I群4型禽腺病毒SD2015株接种SPF鸡胚，收获病变鸡胚的尿囊液、绒毛尿囊膜和胚体，匀浆，冻融，离心取上清液，得到I群4型禽腺病毒SD2015株病毒液。...

【专利技术属性】
技术研发人员：毕志香，于漾，揭鸿英，赵阳，朱亚露，何家惠，侯继波，
申请(专利权)人：江苏省农业科学院，
类型：发明
国别省市：江苏;32